[發明專利]一種提高重組大腸桿菌血紅素合成的方法

在審

• 申請號: 202211522848.1
• 申請日: 2022-11-30
• 公開（公告）號: CN116162583A
• 公開（公告）日: 2023-05-26
• 發明（設計）人: 唐蕾;王悅;張鑫;楊燕;潘梅;劉爽欣;劉琪
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12N15/31;C12N15/53;C12N15/60;C12P17/18;C12R1/19
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 林娟

本發明公開了一種提高重組大腸桿菌血紅素合成的方法，屬于基因工程領域。本發明通過敲除編碼前體物外泌的蛋白基因，解決關鍵前體物外泌的問題，造成PPIX積累，進一步通過優化鐵離子濃度、谷氨酰?tRNA還原酶(HemA)、參與鐵轉運的蛋白(EfeB)和亞鐵螯合酶(HemH)的表達，提高重組大腸桿菌血紅素合成能力，與出發菌株相比生長狀況沒有顯著改變，但胞內血紅素含量大幅提升，血紅素濃度約為出發菌株的4倍，具有良好的應用前景。

技術領域

本發明涉及一種提高重組大腸桿菌血紅素合成的方法，屬于基因工程領域。

背景技術

血紅素(heme)是一種常見的金屬卟啉，由原卟啉Ⅸ(PPIX)通過亞鐵螯合酶在其中心螯合一個Fe²⁺所形成，因此也被稱作鐵卟啉，可以作為發色劑和補鐵劑用于食品加工和制造，而且還可作為廣譜暗淬滅劑進行病理條件下蛋白質功能的熒光檢測，應用廣泛。目前化學合成和使用有機提取或酶水解生物材料制備血紅素的工藝復雜、低產、耗時，且環境非友好。利用重組細菌生物合成血紅素是大規模生產血紅素最有前途的方法，但是目前產量低，不適合工業化生產，因此通過代謝工程改造提升重組菌的血紅素合成能力非常必要。

大腸桿菌(E.coli)作為重要的基因工程宿主菌，主要以谷氨酸為前體物經C5途徑合成血紅素。強化代謝途徑的關鍵酶基因可提高關鍵前體物的產量，因而被用于提高血紅素的含量，如過表達hemA編碼的谷氨酰t-RNA還原酶，可提高前體5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic?acid，5-ALA)的合成，但同時也促進了細胞向外排出5-ALA，造成了細胞資源的浪費。所以如果能夠通過代謝工程改造，解決前體物的外泌的問題，并進一步將代謝流導向血紅素，有望提高菌體的血紅素合成能力。

發明內容

本發明通過敲除編碼前體物外泌的蛋白基因，解決關鍵前體物外泌的問題，造成PPIX積累，進一步通過優化鐵離子濃度、谷氨酰-tRNA還原酶(HemA)、參與鐵轉運的蛋白(EfeB)、亞鐵螯合酶(HemH)的表達，提高重組大腸桿菌血紅素合成能力。

本發明提供了一種基因工程菌，所述基因工程菌敲除外膜通道蛋白TolC和/或轉運蛋白RhtA的編碼基因，和/或，過表達谷氨酰-tRNA還原酶HemA、參與鐵轉運的蛋白EfeB或亞鐵螯合酶HemH中的至少一個。

在一種實施方式中，所述基因工程菌敲除外膜通道蛋白TolC和轉運蛋白RhtA的編碼基因；

或，所述基因工程菌敲除外膜通道蛋白TolC的編碼基因，過表達谷氨酰-tRNA還原酶HemA和亞鐵螯合酶HemH；

或，所述基因工程菌敲除外膜通道蛋白TolC和轉運蛋白RhtA的編碼基因，過表達參與鐵轉運的蛋白EfeB和亞鐵螯合酶HemH；

或，所述基因工程菌敲除外膜通道蛋白TolC和轉運蛋白RhtA的編碼基因，過表達谷氨酰-tRNA還原酶HemA和亞鐵螯合酶HemH。

在一種實施方式中，編碼所述外膜通道蛋白TolC的基因tolC的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，編碼所述谷氨酰-tRNA還原酶HemA的基因hemA的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示，編碼所述亞鐵螯合酶HemH的基因hemH的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.3所示，編碼所述轉運蛋白RhtA的基因rhtA的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.4所示，編碼所述參與鐵轉運的蛋白EfeB的基因efeB的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.5所示。

在一種實施方式中，所述過表達是將基因連接到pET載體進行游離表達。

在一種實施方式中，所述pET載體為pET28a。

在一種實施方式中，所述基因工程菌以大腸桿菌BL21(DE3)為出發菌株。