[發明專利]p16蛋白單克隆抗體的制備方法、免疫試紙條、試劑盒及其應用在審
| 申請號： | 202211515626.7 | 申請日： | 2022-11-29 |
| 公開（公告）號： | CN116063485A | 公開（公告）日： | 2023-05-05 |
| 發明（設計）人： | 楊眉;蔣春樊;邢輝;李琳;武峰 | 申請（專利權）人： | 襄陽市中心醫院 |
| 主分類號： | C07K16/18 | 分類號： | C07K16/18;C07K16/00;G01N33/574;G01N33/543;G01N33/58;G01N33/533 |
| 代理公司： | 深圳市世紀恒程知識產權代理事務所 44287 | 代理人： | 陳滿誼 |
| 地址： | 441000 湖*** | 國省代碼： | 湖北;42 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | p16 蛋白 單克隆抗體 制備 方法 免疫 試紙 試劑盒 及其 應用 | ||
1.一種p16蛋白單克隆抗體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：
S10、將p16蛋白抗原免疫動物，并收集免疫效價合格動物的新鮮脾臟和骨髓，以提取總RNA；
S20、將所述總RNA進行反轉錄，PCR擴增抗體重鏈和輕鏈的可變區基因；
S30、將所述抗體重鏈和輕鏈的可變區基因拼接后，連入噬菌粒載體并電轉化，復蘇擴增獲得抗體庫；
S40、從所述抗體庫中篩選出單克隆陽性噬菌體，并采用雙抗夾心法從所述單克隆陽性噬菌體中篩選出可以配對的單克隆陽性噬菌體；
S50、對可以配對的單克隆陽性噬菌體進行二次特異性功能檢測，并測序獲得抗體序列，即為p16蛋白單克隆抗體。
2.如權利要求1所述的蛋白單克隆抗體的制備方法，其特征在于，步驟S50包括：
S51、對可以配對的單克隆陽性噬菌體進行二次特異性功能檢測，并測序正確后，得第一抗體；
S52、將熒光微球與第一抗體進行震蕩偶聯，得p16蛋白單克隆抗體。
3.一種免疫試紙條，其特征在于，用于檢測人宮頸脫落細胞中的p16蛋白，所述免疫試紙條包括p16蛋白單克隆抗體，所述p16蛋白單克隆抗體通過如權利要求1或2的p16蛋白單克隆抗體的制備方法制得。
4.一種試劑盒，其特征在于，用于檢測人宮頸脫落細胞中的p16蛋白的含量，所述試劑盒包括如權利要求3所述的免疫試紙條。
5.如權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括人體宮頸脫落細胞裂解液，所述人體宮頸脫落細胞裂解液包括：體積分數為0.05％～1％的表面活性劑、10mM～1M的緩沖液以及1mM～10mM的蛋白酶抑制劑。
6.如權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括p16蛋白標準品。
7.一種檢測人宮頸脫落細胞中的p16蛋白的含量的方法，其特征在于，采用如權利要求4至6任意一項所述的試劑盒，所述檢測人宮頸脫落細胞中的p16蛋白的含量的方法包括以下步驟：
S1、將待測人體宮頸脫落細胞加入人體宮頸脫落細胞裂解液中，第一次震蕩后，冷凍并進行第二次震蕩，離心并收集上清；
S2、將所述上清滴加至試紙條上，檢測待測的發光值；
S3、以p16蛋白標準品的濃度為橫坐標，發光值為縱坐標，擬合得到標準曲線方程；
S4、根據待測的發光值和標準曲線方程，計算人宮頸脫落細胞中的p16蛋白的含量。
8.如權利要求7所述的檢測人宮頸脫落細胞中的p16蛋白的含量的方法，其特征在于，在步驟S1中，第一次震蕩時間為2～10min。
9.如權利要求7所述的檢測人宮頸脫落細胞中的p16蛋白的含量的方法，其特征在于，在步驟S1中，第二次震蕩時間為2～10min。
10.如權利要求7所述的檢測人宮頸脫落細胞中的p16蛋白的含量的方法，其特征在于，在步驟S1中，離心時間為10～30min。
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