[發明專利]一種控制枯草芽孢桿菌基因組同源重組概率的方法

在審

• 申請號: 202211514538.5
• 申請日: 2022-11-29
• 公開（公告）號: CN115717152A
• 公開（公告）日: 2023-02-28
• 發明（設計）人: 劉延峰;陳堅;郭豪玉;堵國成;劉龍;李江華;呂雪芹;田榮臻
• 申請（專利權）人: 江南大學;嘉興未來食品研究院
• 主分類號: C12N15/75
• 分類號: C12N15/75;C12N15/31;C12N1/21;A23L29/00;C12R1/125
• 代理公司: 蘇州市中南偉業知識產權代理事務所(普通合伙) 32257
• 代理人: 王玉仙

本發明公開了一種控制枯草芽孢桿菌基因組同源重組概率的方法，屬于基因工程領域。本發明以枯草芽孢桿菌為出發菌株，敲除了編碼RecA蛋白的基因recA或誘導表達基因recA，通過誘導物質的添加調控微生物的同源重組，使得到的工程菌株產量穩定性大大提高。

技術領域

本發明涉及基因工程技術領域，尤其涉及一種控制枯草芽孢桿菌基因組同源重組概率的方法。

背景技術

同源重組又稱一般性重組，發生在DNA的同源序列之間，同源重組是生物界普遍存在的現象，真核生物非姐妹染色單體的交換，姐妹染色單體的交換，細菌及某些低等真核生物的轉化，細菌的轉導、接合等都屬于這一類型。枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)作為革蘭氏陽性菌的模型微生物，用于孢子形成機制和代謝調節的實驗室研究，在自然界廣泛分布，包括土壤表面，水環境和動物胃。它是一種非致病微生物，不含內毒素，并且通常被美國食品和藥物管理局(FDA)認可為安全(GRAS)食品級微生物。此外，枯草芽孢桿菌具有許多優點，包括：細胞生長快，培養時間短，培養要求低，分泌蛋白質能力強，廣泛用于工業酶生產，高附加值產品的生物合成。

然而利用枯草芽孢桿菌進行發酵生產伴隨著多拷貝基因引起的同源重組，這導致產量的降低或消失。控制枯草芽孢桿菌發酵過程同源重組引起的產量下降或消失對于微生物發酵具有重要影響。

目前，人們為了減少同源重組現象進行了許多研究。但進行同源重組時，需同源序列短于75bp，重組頻率才能大大降低。但相比于大腸桿菌遺傳轉化操作所需的50bp長度的同源臂，枯草芽孢桿菌常用同源臂長度為500-1500bp，因此降低枯草芽孢桿菌重組概率無法有效實現。因此，開發一種同源臂長度在大于75bp的情況下仍能降低枯草芽孢桿菌同源重組概率的方法至關重要。

發明內容

為解決上述技術問題，本發明提供了一種控制枯草芽孢桿菌胞內同源重組的方法，是將控制同源重組的關鍵基因recA敲除或誘導表達，使其在發酵過程中不表達RecA蛋白，從而降低同源重組概率，以期解決由于同源重組引起的產量降低或消失問題。

本發明的第一個目的是提供一種控制枯草芽孢桿菌基因組同源重組概率的方法，方法中包括敲除所述枯草芽孢桿菌中編碼RecA蛋白的基因recA或誘導表達recA的步驟。

進一步地，所述編碼RecA蛋白的基因recA的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

進一步地，通過誘導型啟動子以及非天然氨基酸誘導表達recA。通過這種方法，實現在轉錄和翻譯上共同控制recA的表達，可隨時開啟或關閉枯草芽孢桿菌胞內的同源重組。

進一步地，誘導表達recA的具體步驟為：將原啟動子替換為誘導型啟動子，同時將RecA蛋白的第二個密碼子替換為編碼非天然氨基酸的密碼子。優選地，替換密碼子為TAG會在該位點引入非天然氨基酸，需要保證非天然氨基酸的引入對該蛋白的性質不產生影響。第二個位點的改變通過申請人的多次嘗試得到，前期實驗嘗試過第一個、第三個等多個位點均構建失敗，可見并非任意位點引入非天然氨基酸均可，同時，若將很多位點都改成TAG密碼子也不可行，由于RF因子會與引入的tRNA競爭，若將recA中的多個位點都改成TAG，可能會導致蛋白無法正常翻譯。

進一步地，將上述得到的recA缺陷菌株進行培養，若要降低同源重組概率，在培養過程中不加入誘導劑和非天然氨基酸即可。

進一步地，所述的培養為，將所述recA缺陷菌株活化后在種子培養基中培養得到種子液，再將種子液接種至發酵培養基中進行發酵培養。

進一步地，所述種子培養基的組成為：5-15g/L胰蛋白胨，1-10g/L酵母粉，5-15g/LNaCl。

優選地，種子培養基的組成為：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/LNaCl。