[發明專利]利用雙探針檢測核酸的方法和試劑

在審

• 申請號: 202211511703.1
• 申請日: 2022-11-29
• 公開（公告）號: CN115948499A
• 公開（公告）日: 2023-04-11
• 發明（設計）人: 關國良;陳巧玲;賈瑤瑤;金誠
• 申請（專利權）人: 常州先趨醫療科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12Q1/6825;C12Q1/6844;G01N27/48
• 代理公司: 南京中高專利代理有限公司 32333
• 代理人: 金嘯

本發明提供一種利用雙探針檢測核酸的方法和試劑，雙探針組合至少包括：信號探針和捕獲探針；所述信號探針為含有能與目標核酸第一靶點區域互補配對的核苷酸序列的單鏈核酸，且所述信號探針上標記有氧化還原分子；所述捕獲探針為含有能與目標核酸序列第二靶點區域互補配對的核苷酸序列的單鏈核酸。本文中的雙探針提高了檢測的特異性，尤其是排除了二聚體或者多聚體產生的假陽性。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，特別是涉及利用雙探針檢測核酸的方法和試劑。

背景技術

目前，通過電化學生物傳感器對目標核酸的檢測原理主要是通過一條固定在電極上的特異性DNA，與目標核酸配對雜交，引起電信號變化，實現核酸的檢測。基于該原理的各種方法通常引起的電信號為電流或阻抗的數值移動，即高電流到低電流(或低電流到高電流)或高阻抗到低阻抗(或低阻抗到高阻抗)的變化，這一變化均表現為檢測電信號數值的改變，即量變。這使得陽性與陰性結果的信號受外界影響因素大，例如使用緩沖液內的離子濃度，單一DNA探針的性質及濃度等。因此這種方法難以界定一個明確的區分線，局限了電化學生物傳感器的實際應用。同時，當非目標核酸有部分片段與目標核酸一致或非常相似時，由于這種序列相似的非目標核酸可能與DNA探針發生部分雜交結合，引起類似陽性信號的電信號，導致特異性較低。

還有通過對DNA探針形態進行設計，如初始探針為螺旋狀短結構，由于電化學標記距離電極距離較近而產生強信號，當目標核酸存在時，由于與DNA探針雜交結合，將螺旋結構解開拉直，導致電化學標記與電極距離變遠，引起電信號變弱。這種方法檢測的是同一電信號的強弱變化，量變的具體區分值差異較小，難以準確分辨，導致該方法準確性較低。同時單一探針同樣有與相似序列的非特異性片段結合，從而引起信號變化，導致特異性較低的問題。

因此，科學工作都致力于開發研究出新的探針，避免上述情況的出現。

發明內容

鑒于以上所述現有技術的缺點，本發明的目的在于提供一種利用雙探針檢測核酸的方法和試劑盒，用于解決現有技術中針對核酸樣本檢測特異性差的問題。

本發明的一方面提供了一種核酸檢測探針組合，所述探針組合包括：信號探針和捕獲探針；所述信號探針含有與目標核酸序列第一靶點區域互補配對的核苷酸序列的單鏈核酸，且所述信號探針上標記有氧化還原分子；所述捕獲探針為與目標核酸第二靶點區域互補配對的核苷酸序列的單鏈核酸。

信號探針和捕獲探針分別存放，存在于不同的體系中。

所述第一靶點區域和第二靶點區域緊密相連，且兩者之間無核苷酸，且兩者之間無核苷酸,可參考圖1，可見在目標核酸上，與信號探針互補配對的區域緊密連著捕獲探針互補配對的區域。兩個區域之間無間隔。

優選地，所述信號探針與目標核酸序列互補配對的長度為10-30個核苷酸。通常來說其總長度不超過100個核苷酸；所述捕獲探針與目標核酸序列互補配對的長度為10-24個核苷酸；通常來說其總長度也不超過100個核苷酸。

優選地，所述信號探針與目標核酸序列互補配對的區域為規律排列的DNA序列。該序列需要滿足GC堿基與AT堿基比例平衡的原則，且不易與目標序列發生非特異性雜交結合。

例如，所述信號探針含有目標核酸序列互補配對的區域及一個為循環AGAC、TCTG、TGTC、ACAG中任一的尾端序列。

優選地，所述氧化還原分子可以為亞甲基藍或二茂鐵。

優選地，所述捕獲探針上有或沒有修飾能夠與電極連接的殘基。當捕獲探針與電極之間可形成物理吸附時，則無需修飾，當捕獲探針與電極之間形成化學吸附時，則需要修飾可與電極兩結合的基團。

優選地，當所述電極為金電極時，所述捕獲探針的尾端采用-SH修飾；-SH可以和金電極形成-S-Au鍵。