[發明專利]一種測定人血漿中阿普斯特濃度的檢測方法

有效

• 申請號: 202211497301.0
• 申請日: 2022-11-28
• 公開（公告）號: CN115541778B
• 公開（公告）日: 2023-08-15
• 發明（設計）人: 張迅杰;石峰;鞏麗萍;咸瑞卿;賀美蓮;李春煥;由鵬飛;王聰聰
• 申請（專利權）人: 山東省食品藥品檢驗研究院
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/72;G01N30/06;G01N30/34
• 代理公司: 北京元本知識產權代理事務所(普通合伙) 11308
• 代理人: 徐蘋

1.一種血漿中阿普斯特濃度的檢測方法，其特征在于，由以下步驟實現：

將含阿普斯特的血漿樣品、阿普斯特-d5的乙腈溶液混合進行蛋白沉淀反應，將所得上清液稀釋后注入液相色譜-質譜儀，采用多反應監測掃描模式進行檢測，用內標法以標準曲線計算血漿中阿普斯特的濃度，所述標準曲線以阿普斯特的濃度為橫坐標，以阿普斯特和阿普斯特-d5的峰面積比值為縱坐標；

所述混合進行蛋白沉淀反應的具體操作為：取2?mL深孔96孔板，每孔加100?μL含阿普斯特的血漿樣品，再加質量濃度為20.0ng/mL內標工作溶液300?μL，渦旋混合5?min，置4℃96孔板臺式高速冷凍離心機中4750?r/min離心10min，每孔取100?μL上清液，轉移至另一新的2?mL深孔96孔板，再向其中加10%乙腈水溶液100?μL稀釋，渦旋混合5?min，啟動液質聯用儀檢測程序對血漿中的阿普斯特進行檢測；

所述標準曲線由包括以下步驟的方法制得：稱量1?mg阿普斯特，用N，N-二甲基甲酰胺溶解得到1?mg/mL的阿普斯特母液，用50%乙腈水溶液稀釋至質量濃度為100?ng/mL阿普斯特工作溶液，再用50%乙腈水溶液將所述工作溶液稀釋成40、80、200、600，2000，4000，9600和12000?ng/mL的標準曲線工作液，取空白血漿285?μL，加入不同濃度的標準曲線工作液15μL，得到2.0，4.0，10.0，30.0，100.0，200.0，480.0和600.0?ng/mL的標準曲線樣品；取所述標準曲線樣品100?μL，加400?μL阿普斯特-d5的乙腈溶液進行沉淀反應，渦旋混合5?min，置4℃臺式高速冷凍離心機中，4750?r/min離心10?min，每孔取上清100?μL，轉移至另一96孔板，每孔加10%乙腈水溶液100?μL稀釋，渦旋混合5?min進行液質聯用檢測分析，使用內標法對所得數據進行處理，以阿普斯特的濃度為橫坐標，阿普斯特和阿普斯特-d5的峰面積比值為縱坐標，以1/x²為權重系數，利用加權最小二乘法進行線性回歸，得到所述標準曲線；

所述內標工作溶液為阿普斯特-d5的乙腈溶液，其配制方法為：稱量1?mg阿普斯特-d5標準品，用N，N-二甲基甲酰胺溶解，配成1?mg/mL的內標母液，用乙腈溶液進一步將內標母液稀釋為濃度為20.0?ng/mL阿普斯特-d5的乙腈溶液。

2.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述采用多反應監測掃描模式進行檢測中，所述阿普斯特的定量離子對為461.2→257.1，所述阿普斯特-d5的離子對為466.1→262.3。

3.?根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述液相色譜-質譜儀中液相條件為：色譜柱為Phenomenex?Kinetex?C18?(2.1×50?mm，2.6?μm)色譜柱，流動相A為含0.1%甲酸的水溶液，流動相B為0.1%甲酸乙腈溶液，采用梯度洗脫，洗脫程序為洗脫程序為：0~0.5min，流動相A的體積百分含量保持63%，流動相B的體積含量保持37%；0.5~1.3?min，流動相A的體積百分含量從63%下降到0.0%，流動相B的體積百分含量從37%上升到100%；1.3~2.4min，流動相A的體積百分含量保持0.0%，流動相B的體積含量保持100%；2.4~2.41?min，流動相A的體積百分含量從0.0%上升到63%，流動相B的體積百分含量從100%下降到37%；2.41~3.0?min，流動相A的體積百分含量保持63%，流動相B的體積含量保持37%，流速為0.45?mL/min，柱溫為40℃，進樣量為5?μL。

4.?根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述液相色譜-質譜儀中質譜條件為：使用三重四級桿質譜儀，離子源為電噴霧離子源，負離子模式，采用多反應監測掃描模式，離子化電壓：5500?V?；入口電壓：10?V；碰撞室出口電壓：13?V；噴霧氣：50；輔助加熱氣：55；氣簾氣：35，碰撞能量：14?V，去簇電壓：190?V。