[發明專利]一種重組大腸桿菌靜息細胞催化異戊烯醇高效制備冷杉醇的方法

在審

• 申請號: 202211494822.0
• 申請日: 2022-11-26
• 公開（公告）號: CN115820702A
• 公開（公告）日: 2023-03-21
• 發明（設計）人: 楊雪鵬;王光路;劉蘭茜;胡仙妹;鐘桂芳;王冰洋;王夢圓;李乾
• 申請（專利權）人: 鄭州輕工業大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/54;C12N15/55;C12N15/59;C12N15/60;C12N15/31;C12P7/02;C12R1/19
• 代理公司: 鄭州市華翔專利代理事務所(普通合伙) 41122
• 代理人: 張愛軍

冷杉醇降解產生龍涎香香氣物質，可改善煙草香味品質，廣泛應用于香料工業。本發明開發了一種低成本、高效的靜息細胞催化制備冷杉醇新方法。通過敲除去磷酸化酶編碼基因phoA、ybjG、pgpB及外膜脂蛋白編碼基因nlpⅠ，組成型過表達脂肪酸代謝轉錄調節子編碼基因fadR和甘油代謝操縱子基因glpFK，過表達羥乙基噻唑激酶、異戊烯基磷酸激酶、異戊烯基二磷酸δ?異構酶、雙功能二磷酸法呢基合酶、香葉基香葉基二磷酸合酶、賴百當?13?烯?8?醇二磷酸合酶和冷杉醇合酶獲得重組大腸桿菌。采用靜息細胞催化工藝可于24h催化3.0g/L異戊烯醇生成1.80g/L冷杉醇，轉化率達71.15％，遠高于目前文獻及專利報道水平。靜息細胞可重復使用5?6次，操作簡單、經濟性好，相比發酵法有更佳的規模制備冷杉醇潛力。

技術領域

本發明涉及一種重組大腸桿菌靜息細胞催化異戊烯醇高效制備冷杉醇的方法，屬于生物工程領域。

背景技術

萜類物質是普遍存在的植物次生代謝物，也是煙草最重要的一類致香組分。尤其是煙草中二萜烯醇類化合物——主要包括西柏烯醇類與賴百當醇類化合物，對于煙草的香氣品質具有重要影響；其含量差異與不同類型煙草的品質特征具有顯著相關性，且其降解產物均是代表性的煙草香味物質。在香料煙中，賴百當類是常見二萜烯醇化合物，其中順-冷杉醇是大部分香料煙和部分雪茄煙中特有的香氣前體物，對煙草香氣特征具有重要作用，其降解產生強烈龍涎香香氣的物質，對增加卷煙香氣和吸味非常有效，與煙草的特征香韻諧調和合，并可掩蓋雜氣，即使微量使用，也可改善煙草的香味品質，尤其適合混合型卷煙加香，常用于卷煙浸膏。順-冷杉醇作為琥珀樣龍涎香的半合成前體物，因其優美的香氣、良好的定香效果及對煙氣質量的影響，被廣泛應用于香料工業。目前煙草特征香味前體物質冷杉醇多采用提取法，以富含冷杉醇煙葉中提取而來，而冷杉醇在煙葉中含量較低，同時受制于煙草原料的獲得，成為制約提取法大規模應用的瓶頸。近年來，隨著合成生物學迅速發展，微生物發酵法成為冷杉醇合成研究熱點，前已有文獻及專利報道以葡萄糖或甘油為底物通過微生物發酵法生物合成冷杉醇。但受制于底物甘油或葡萄糖做為底物同時參與細胞多個反應，盡管強化了冷杉醇異源合成途徑和前體物供給，但合成效率依然較低。Li等通過強化冷杉醇異源合成途徑和前體物供給，在1.3L發酵罐中發酵培養工程菌株約100h，冷杉醇產量～634.7mg/L(Li.etal.(2019).Combinatorial Engineering of MevalonatePathway and Diterpenoid Synthases in Escherichia coli for cis-AbienolProduction.Journal of Agricultural and Food Chemistry,67(23),6523-6531.)。Cheng等同樣通過強化前體物供給獲得了工程菌株，發酵培養52h冷杉醇產量～220mg/L，產量較低(Cheng.et al.(2020).Improved cis-Abienol production through increasingprecursor supply in Escherichia coli.Scientific Reports,10(1),16791)。Zhang等以異戊烯醇為底物生物發酵合成冷杉醇，在1.3L發酵罐中進行發酵約144h，轉化底物6.8g/L異戊烯醇合成1375.7mg/L冷杉醇，產量大幅提升，但整體發酵時間過長，且底物轉化率僅為24.1％(Zhang.et al.(2022).Engineering Escherichia coli for effective andeconomic production of cis-abienol by optimizing isopentenol utilizationpathway.Journal of Cleaner Production,351)。因此目前微生物發酵法合成冷杉醇產率仍較低，合成水平不夠理想。由于發酵過程采用有機相對發酵體系進行萃取，其萃取產物會摻雜除冷杉醇外大量來自于發酵液中脂溶性物質(如培養基中脂溶性成分、脂溶性細胞內含物、脂溶性細胞代謝產物等)，這對后續分離純化及應用帶來困難。因此，亟待開發一種產率高、成本低且具有高效率的冷杉醇合成方法。