[發明專利]一種雙環吉瑪烯合成酶突變體和基因序列以及應用

在審

• 申請號: 202211475718.7
• 申請日: 2022-11-23
• 公開（公告）號: CN115948374A
• 公開（公告）日: 2023-04-11
• 發明（設計）人: 喬建軍;閆曉光;聶升鑫;梁冬梅;李鈺琨;葛建君
• 申請（專利權）人: 天津大學浙江紹興研究院
• 主分類號: C12N9/88
• 分類號: C12N9/88;C12N15/60;C12N15/81;C12N1/19;C12P5/00;C12R1/865
• 代理公司: 天津市北洋有限責任專利代理事務所 12201
• 代理人: 琪琛

本發明公開了一種雙環吉瑪烯合成酶突變體和基因序列以及應用。所述雙環吉瑪烯合酶突變體包括以SEQ?ID?NO.1所示野生型的雙環吉瑪烯合成酶核苷酸序列為模板，第290位異亮氨酸突變為纈氨酸形成的突變體I290V；第316位異亮氨酸突變為亮氨酸形成的突變體I316L；第454位亮氨酸突變為半胱氨酸形成的突變體L454C；第290位異亮氨酸突變為纈氨酸，第316位異亮氨酸突變為亮氨酸，以及第454位亮氨酸突變為半胱氨酸形成的組合突變體I290V/I316L/L454C。本發明通過酶工程手段改造雙環吉瑪烯合成酶以提高雙環吉瑪烯的產量，為萜烯合酶類的改造提供了參考，具有重要的生產意義和實際的應用價值。

技術領域

本發明屬于酶基因工程及酶工程領域，具體涉及一種來源于馬鞭草(Lippiadulcis)的雙環吉瑪烯合成酶LdTPS5突變體及其編碼基因以及應用。

背景技術

雙環吉瑪烯是一種重要的雙環倍半萜，是雄性激素(androgen)、雌性激素(estrogen)、孕酮(progesterone)和多巴胺(dopamine)等人體激素的潛在受體，有治療內分泌疾病的潛力。雙環吉瑪烯可能是具有抑菌活性的香橙烯、白千層醇、藍桉醇、喇叭醇和喇叭茶醇(palustrol)等香橙烯型倍半萜合成的重要中間體，也可能是一些具有抑菌活性的雜環萜如psiguadials?A和macrocarpal?A的重要合成骨架。目前，雙環吉瑪烯合成酶的催化效率以及特異性催化限制了雙環吉瑪烯的利用，因此通過酶工程手段對雙環吉瑪烯合成酶進行改造以提高雙環吉瑪烯產量具有重要的生產意義和應用價值。

發明內容

本發明的目的在于，提供一種雙環吉瑪烯合成酶LdTPS5突變體及其基因序列，以解決雙環吉瑪烯合成酶的催化效率低以及產物特異性差導致的雙環吉瑪烯產量低的問題。

為了解決上述技術問題，本發明采用以下技術方案：

根據本發明的第一方面，提供一種雙環吉瑪烯合成酶突變體，所述雙環吉瑪烯合成酶突變體包括以SEQ?ID?NO.1所示野生型的雙環吉瑪烯合成酶核苷酸序列為模板，分別進行四個位點突變，獲得四個突變體，所述四個突變體為：第290位異亮氨酸突變為纈氨酸形成的突變體I290V，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示；第316位異亮氨酸突變為亮氨酸形成的突變體I316L，其氨基酸序列如SEQ?IDNO.3所示；第454位亮氨酸突變為半胱氨酸形成的突變體L454C，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.4所示；第290位異亮氨酸突變為纈氨酸，第316位異亮氨酸突變為亮氨酸以及第454位亮氨酸突變為半胱氨酸形成的組合突變體I290V/I316L/L454C，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.5所示。

根據本發明的第二方面，提供一種雙環吉瑪烯合成酶突變體的編碼基因，其特征在于，所述編碼基因編碼如上所述的任意一種雙環吉瑪烯合成酶突變體的氨基酸序列。

根據本發明的第三方面，提供一種包含所述雙環吉瑪烯合成酶突變體的編碼基因的重組表達載體。

根據本發明的一個優選實施方案，所述重組表達載體中的載體質粒為pESC-URA，啟動子為Gal1誘導性啟動子。但是應當理解的是，本發明并不僅限于該載體質粒和啟動子，還可以是其他任何適合的載體質粒和啟動子。

根據本發明的第四方面，提供一種如上所述的雙環吉瑪烯合成酶突變體的編碼基因的重組基因工程菌。

根據本發明的第五方面，提供一種所述雙環吉瑪烯合酶突變體在酵母中合成雙環吉瑪烯中的應用。

所述應用包括：將一種包含所述雙環吉瑪烯合酶突變體的編碼基因的重組表達載體轉入酵母宿主菌中，將所述重組基因工程菌接種到尿嘧啶缺陷型選擇性培養基中發酵120h，從而獲得包含雙環吉瑪烯的產物。

在所述應用中，優選地，在24h時添加終濃度為10g/L的半乳糖進行蛋白的誘導表達，同時添加10％正十二烷進行雙相發酵培養以減少雙環吉瑪烯的損失。