[發明專利]pEcCas9-2.0質粒及其構建方法和應用

在審

• 申請號: 202211474046.8
• 申請日: 2022-11-23
• 公開（公告）號: CN115851798A
• 公開（公告）日: 2023-03-28
• 發明（設計）人: 李琦;楊晟;左勇;孫銘君;呂露;伍婷;張克粉
• 申請（專利權）人: 四川師范大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/64;A61K48/00;A61P31/04;C12R1/19
• 代理公司: 西安銘澤知識產權代理事務所(普通合伙) 61223
• 代理人: 崔瑞迎

本發明涉及基因工程技術領域，具體公開了pEcCas9?2.0質粒及其構建方法和應用，所述pEcCas9?2.0質粒包括表達Cas9蛋白的基因cas9，λ?red重組系統gam、bet、exo，阿拉伯糖操縱子araC，p15A復制子，氯霉素抗性基因CmR。本發明構建得到的pEcCas9?2.0質粒可在大腸桿菌MG1655基因編輯中實現低于10^?8的逃逸率，在大腸桿菌中能夠達到100％的基因編輯率。

技術領域

本發明涉及基因工程技術領域，具體涉及pEcCas9-2.0質粒及其構建方法和應用。

背景技術

CRISPR-Cas是許多細菌和古細菌中的獲得性免疫系統，用來抵御外源遺傳物質的入侵，目前已被開發成基因編輯工具并廣泛用于各種生物中。Cas9等Cas家族蛋白質能在向導RNA引導下切割宿主基因組導致宿主DNA雙鏈斷裂，宿主主要通過同源重組和非同源末端連接兩條途徑對斷裂的DNA雙鏈進行修復，然而大部分細菌缺乏內源的非同源末端連接途徑。因此目前細菌中基于CRISPR-Cas的基因敲除或插入工具多是通過外源提供修復模板，借助同源重組修復來實現，而在無外源修復模板情況下，CRISPR-Cas引起的DNA雙鏈斷裂通常是無法被修復的，并將導致細菌死亡。借助該原理，CRISPR-Cas可被開發成抗菌劑用于清除微生物群落中特定菌株，在抗生素耐藥性和精確微生物組工程的時代，CRISPR-Cas抗菌劑有望對我們未來治療疾病的方式產生重大影響。相對于抗生素而言，CRISPR-Cas系統具有高度的特異性與方便的可編程性，能從菌株水平進行識別和消除目標菌株，而不影響原本的微生物群落。目前已有研究報道利用噬菌體來“輸送”CRISPR-Cas元件，以實現對腸道微生物中病原細菌如耐藥性大腸桿菌進行清除；也有研究將其用于清除用于診斷和治療各種疾病的工程益生菌，以防止工程益生菌在環境中的傳播。

然而，在實際應用情況下，多數細菌在無外源修復模板情況下也能存活(即為逃逸子)，比例約為10^-6至10^-1。美國國立衛生研究院強調：10⁸個細胞中逃逸1個及以下的細胞被認為是可接受的清除效率(即逃逸率不能高于10^-8)。逃逸子的存在，不僅阻礙了CRISPR在抗菌劑方面的應用，同時也使得在細菌中進行基因編輯如基因敲除時的效率降低。因此了解逃逸的原因可加快高效抑菌劑的開發,也有助于高效基因編輯工具的開發。

在關于逃逸的機制研究方面，研究人員們主要從改造菌株和改造工具兩個角度對逃逸進行了研究。

在改造菌株方面，有研究表明：大腸桿菌可以通過RecA蛋白介導的SOS反應對斷裂DNA進行修復上調易錯DNA聚合酶的表達，進而容易造成靶標DNA的突變，導致使修復的新序列無法被原gRNA識別并進行二次切割，從而逃避了無修復同源臂下CRISPR-Cas誘導的細胞死亡。易錯DNA聚合酶表達的上調在提高靶標DNA突變率的同時，也會提高Cas9蛋白等CRISPR相關基因的突變率，從而進一部提高細菌在Cas9蛋白的切割中的逃逸率。因此，CRISPR-Cas系統在recA突變體中的表達更有效。

但是基于CRISPR的抑菌劑或實現高效編輯的工具需從優化基因編輯工具本身入手，而非通過改造目標菌株，如敲除基因等來輔助工具以實現高效編輯。受限于逃逸機制的研究，目前僅有提高Cas蛋白活性，篩選gRNA文庫以確定染色體不同切割位置對逃逸率的影響以及抑制DNA修復途徑幾種方法，例如在質粒中表達能與斷裂DNA雙鏈兩端結合的Gam蛋白的基因，來抑制細菌對斷裂基因組的修復進而降低逃逸率。由于DNA雙鏈斷裂誘導的SOS應答能夠促進易錯DNA聚合酶導致的突變，使得細胞逃逸CRISPR-Cas9靶向切割的概率提高。有研究基于Cas9與RecA56共表達的質粒系統，將RecA的突變體RecA56疊加到Cas9表達質粒上，通過RecA56的引入，削弱了野生型RecA的活性，進而不能正常開啟易錯DNA聚合酶的表達的上調途徑以此達到提高CRISPR-Cas9介導的切割效率，減少逃逸的目的，但優化后工具的逃逸率仍高于10^-8。

發明內容