[發明專利]Ⅰ型貓冠狀病毒病毒樣顆粒、制備方法及應用

有效

• 申請號: 202211448524.8
• 申請日: 2022-11-18
• 公開（公告）號: CN115747231B
• 公開（公告）日: 2023-08-04
• 發明（設計）人: 張斌;周群;宋鑫
• 申請（專利權）人: 西南民族大學
• 主分類號: C12N15/50
• 分類號: C12N15/50;C12N15/11;C12N15/866;C07K14/165;A61K39/215;A61P31/14
• 代理公司: 成都華風專利事務所(普通合伙) 51223
• 代理人: 杜朗宇

本發明公開了一種Ⅰ型貓冠狀病毒病毒樣顆粒、制備方法及應用，所述Ⅰ型貓冠狀病毒病毒樣顆粒由能夠穩定分泌貓冠狀病毒E、M、N和S蛋白的四種重組桿狀病毒共感染后組裝生成，包含完整的貓冠狀病毒E、M、N和S蛋白，大小約70～120nm，形態與天然病毒一致。將本發明得到的Ⅰ型貓冠狀病毒病毒樣顆粒免疫小鼠后能夠均能夠產生高滴度的抗體水平，同時刺激機體產生細胞免疫。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，特別是涉及Ⅰ型貓冠狀病毒病毒樣顆粒、制備方法及應用。

背景技術

貓冠狀病毒(Feline?coronavirus,?FCoV)屬于冠狀病毒科，α冠狀病毒屬，編碼四種結構蛋白：纖突糖蛋白（S）、膜蛋白（M）、包膜蛋白（E）和核衣殼蛋白（N）。冠狀病毒的S蛋白是一種膜糖蛋白，被認為是結合和進入細胞的病毒調節因子，是誘導中和抗體產生的主要抗原。M蛋白是最豐富的包膜蛋白，可驅動其他結構組裝入VLP中。E蛋白與M蛋白均可促進病毒粒子組裝和釋放。N蛋白是病毒核衣殼中唯一已知的蛋白組成部分。FCoV首先會入侵小腸絨毛上皮細胞并在細胞內復制，感染后2-3天FCoV會通過糞便進行散毒，這種感染通常是無癥狀的，但有時會伴有腸炎表現。感染后2周，可在結腸內發現病毒，而回盲交界處是持續性感染無癥狀病毒攜帶貓的主要病毒復制部位。

FCoV根據S蛋白氨基酸序列差異分為2種基因型：I型和II型。基因I型FCoV是主要流行基因型，在世界范圍內廣泛流行，感染率高達80-95%；基因II型FCoV由犬冠狀病毒(Canine?coronavirus，CCoV)和基因?型FCoV同源重組而來，在臨床中不常見，主要流行與亞洲地區。根據導致的臨床癥狀和病理變化FCoV又可分為貓腸道冠狀病毒（Felineenteric?coronavirus，FECV）和貓傳染性腹膜炎病毒（Feline?infectious?peritonitisvirus，FIPV）兩種生物型。目前普遍認為，FIPV是由FECV在貓體內發生突變而來。FIPV導致的貓傳染性腹膜炎（Feline?infectious?peritonitis，FIP）是一種慢性致死性疾病，主要特征為腹腔積液或者胸腔積液，剖檢可見腹腔含有纖維蛋白的淡黃色積液，在肝臟、腎臟和網膜表面存在白色顆粒狀的炎性滲出物，覆蓋肝臟或脾臟并延伸到實質中，是各年齡階段的貓死亡的主要原因之一。FECV的感染則僅局限于消化道，會引起貓的體溫上升，食欲不振甚至脫水等癥狀。基因I型和II型FCoV均可在體內突變為FIPV。

在冠狀病毒家族中，嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2型(Severe?AcuteRespiratory?Syndrome?Coronavirus?2,?SARS-CoV-2)、豬流行性腹瀉病毒（PorcineEpizootic?Diarrhea?Virus，PEDV）和牛冠狀病毒(Bovine?CoV,?BCoV)等的病毒樣顆粒(Virus-like?particles,?VLPs)均已在實驗室構建成功。VLPs由于其缺乏病毒遺傳物質并且空間構象類似于真實病毒，具有良好的安全性和免疫原性，近年來已成為疫苗研究領域的熱點。桿狀病毒-昆蟲細胞系統蛋白表達產量高，并且顯示完整的包括糖基化在內的翻譯后修飾，是目前表達生產VLPs應用最為廣泛的系統。到目前為止，幾種基于VLPs的疫苗已經商品化生產，例如重組乙型肝炎病毒（Hepatitis?B?Virus，HBV）疫苗、人乳頭瘤病毒（HumanPapillomavirus，HPV）疫苗、人戊肝病毒（Hepatitis?E?Virus，HEV）疫苗和豬圓環病毒2型（Porcine?circovirus-2,?PCV-2）疫苗等，但FCoV的VLPs仍未見報道。

發明內容

為了解決現有技術中存在的問題，本發明的目的在于提供Ⅰ型貓冠狀病毒病毒樣顆粒、制備方法及應用。

第一方面，本發明提供一種Ⅰ型貓冠狀病毒結構蛋白基因，包括以下蛋白中的至少一種：包膜蛋白E基因、膜蛋白M基因、核衣殼蛋白N基因和纖突糖蛋白S基因，并進行擴增；

所述包膜蛋白E基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示；