[發明專利]一種活性提高的肌酸脒基水解酶突變體

在審

• 申請號: 202211447024.2
• 申請日: 2020-08-28
• 公開（公告）號: CN115851681A
• 公開（公告）日: 2023-03-28
• 發明（設計）人: 楊廣宇;白雪;羅漫杰;宮安;王梁
• 申請（專利權）人: 上海瀚諾威生物科技有限公司
• 主分類號: C12N9/78
• 分類號: C12N9/78;C12N15/55;C12N15/70;C12N15/75;C12N15/81;C12N1/21;C12N1/19;C12R1/19;C12R1/125
• 代理公司: 上海旭誠知識產權代理有限公司 31220
• 代理人: 鄭立

本發明公開了一種活性提高的肌酸脒基水解酶突變體，屬于酶工程技術領域。本發明利用無系統發育偏見的共識方法對肌酸脒基水解酶序列進行分析，篩選得到活性顯著提升的單點突變體并對其進行定點突變，獲得對活性提高的突變酶D17V/K351E，T199S/K351E，D17V/T199S/K351E，D17V/T117P/K351E與野生型相比，這些突變酶的活力提升2倍左右。

本申請是以下申請的分案申請：申請日：2020年8月28日；申請號：202010888788.X；發明名稱“一種活性提高的肌酸脒基水解酶突變體”。

技術領域

本發明屬于生物工程領域，具體涉及一種活性提高的肌酸脒基水解酶突變體。

背景技術

肌酸脒基水解酶是酶促方法檢測肌酐含量的必不可少的酶，它能夠將肌酸轉化成肌氨酸和尿素，進一步生成能夠進行化學檢測的過氧化氫。該酶主要來源于微生物，目前已被廣泛應用于醫療診斷、有機合成等行業。

肌酸脒基水解酶用于工業上測定肌酐含量，除此之外，也經常被用于臨床分析診斷血清和尿液中肌酐含量和與健康機體中肌酐含量不同的腎臟疾病。肌酐是應用人體磷酸肌酸代謝的最終產物，經腎臟過濾后，再從血液中進入尿液，排出體外。一般來說，血清肌酐的正常范圍在35～150μm之間，但當腎功能或肌肉功能出現問題時，肌酐含量會上升至1000μm，血液和尿液中的肌酐含量可以反映腎臟的排泄功能。目前為止檢測肌酐含量最常用的是Jaffe化學檢測方法和酶比色法。相比之下，由于酶促法檢較高的靈敏度和選擇性等特點，日益受到關注。在酶促檢測方法中，待測樣品通過肌肝水解酶，肌酸脒基水解酶和肌氨酸氧化酶連續轉化，最終肌酐被降解為過氧化氫，通過在辣根過氧化物酶催化下的比色反應來確定過氧化氫的濃度，從而達到檢測肌酐含量的目的。

因此，為了更好的將肌酸脒基水解酶應用于臨床肌酐檢測，本發明采用定點突變，獲得了活性顯著提升的突變酶，解決了現有的肌酸脒基水解酶活力較差的缺陷不能滿足應用于試劑的需求，為拓寬肌酸脒基水解酶的工業應用奠定了基礎。

發明內容

為了更好的將肌酸脒基水解酶應用于臨床肌酐檢測，本發明采用定點突變，獲得了活性顯著提升的突變酶，解決了現有的肌酸脒基水解酶活力較差的缺陷不能滿足應用于試劑的需求，為拓寬肌酸脒基水解酶的工業應用奠定了基礎。

本發明第一個目的是提供一種肌酸脒基水解酶的突變體，所述肌酸脒基水解酶突變體為如下(a1)或(a2)：

(a1)將SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列經取代、缺失或添加一個或多個氨基酸且與SEQ ID NO.1的蛋白具有相同功能的衍生蛋白；

(a2)通過一個或多個氨基酸殘基取代SEQ ID NO.1示的氨基酸序列的一個或多個位置且與SEQ ID NO.1示的蛋白表現出至少92％同源性的衍生蛋白。

優選地，該肌酸脒基水解酶突變體，SEQ ID NO.1示的氨基酸序列的突變位點包括以下至少一個：第17位、第58位、第117位、第199位及第351位。

進一步優選地，該肌酸脒基水解酶突變體，所述肌酸脒基水解酶突變體包括在SEQID NO.1示的氨基酸序列上D17V、G58D、T117P、T199S、K351E中任一單點突變位點的單點突變體。

進一步優選地，該肌酸脒基水解酶突變體，所述肌酸脒基水解酶突變體包括在SEQID NO.1所示的氨基酸序列上D17V/G58D、D17V/T117P、D17V/K351E、D17V/T199S、T199S/K351E、D17V/T199S/K351E、D17V/T117P/T199S、D17V/T117P/K351E。

本發明的第二個目的是提供編碼肌酸脒基水解酶突變體的基因。

在本發明的一種實施方式中，所述基因含有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。