[發明專利]一種胰腺炎癥轉化為胰腺癌模型及其構建方法與應用

在審

• 申請號: 202211410205.8
• 申請日: 2022-11-11
• 公開（公告）號: CN116042711A
• 公開（公告）日: 2023-05-02
• 發明（設計）人: 李南南
• 申請（專利權）人: 康德（深圳）生物技術有限公司
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/113;C12N9/22;A01K67/027;A61K49/00
• 代理公司: 大連智高專利事務所(特殊普通合伙) 21235
• 代理人: 胡景波

1.一種胰腺炎癥轉化為胰腺癌模型，其特征在于，敲除小鼠3號染色體的S100A9基因。

2.一種胰腺炎癥轉化為胰腺癌模型的構建方法，其特征在于，包括如下步驟：

步驟一：采用“胰膽管逆行注射?；悄懰徕c法”構建胰腺炎小鼠模型；

步驟二：利用流式細胞儀檢測胰腺腺泡細胞ROS的釋放水平；

步驟三：H₂O₂誘導小鼠原代胰腺腺泡細胞出現ADM表型；

步驟四：構建S100A9穩定過表達的266-6細胞株；

步驟五：構建s100a9-/-C57BL/6小鼠；

步驟六：觀察S100A9在胰腺ADM及胰腺炎惡性轉化中的作用。

3.如權利要求2所述的一種胰腺炎癥轉化為胰腺癌模型的構建方法，其特征在于，所述步驟一的具體方法如下：

大鼠禁食12h，自由飲水，腹腔注射40mg/kg戊巴比妥鈉進行麻醉，麻醉成功后取仰臥位，固定于鼠板，上腹部脫毛備皮，在無菌操作下行正中切口入腹，充分暴露術野，用小動脈夾夾閉肝門處胰膽管，于胰膽管匯合處逆行注射5.0％?；悄懰徕c，以0.1mg/100g體重注射。

4.如權利要求2所述的一種胰腺炎癥轉化為胰腺癌模型的構建方法，其特征在于，所述步驟二的具體方法如下：

①按照“原代胰腺腺泡細胞提取分離”的方法提取分離胰腺炎誘導ADM病變小鼠的原代胰腺腺泡細胞，體外繼續培養24h；

②按照1:1,000比例用無血清培養液稀釋DCFH-DA探針，使其終濃度為10μM；

③收集原代胰腺腺泡細胞，重懸于稀釋好的DCFH-DA溶液中，37℃孵育20min，每隔3～5min顛倒混勻一下，使探針和細胞充分接觸；

④細胞用無血清細胞培養液充分洗滌，最后采用流式細胞儀進行檢測。

5.如權利要求2所述的一種胰腺炎癥轉化為胰腺癌模型的構建方法，其特征在于，所述步驟三的具體方法如下：提取分離正常小鼠的原代胰腺腺泡細胞，并將其接種于96孔板中，細胞貼壁之后，每孔分別加入200μL?H₂O₂終濃度為0、25、50、100和200μM的Waymouth's完全培養基，在37℃和5％CO₂的恒溫培養箱中進行24h培養，然后每孔更換200μL完全培養基，并加入20μL?5mg/mL的MTT溶液，繼續在培養箱中培養，4h后終止培養，小心吸去孔內培養液，每孔加入100μLDMSO，低速振蕩10min充分溶解紫色結晶物，最后采用多功能酶標儀在490nm波長下測量各孔的OD值，同時設置調零孔和對照孔，計算各組間的相對細胞活力，以此評價H₂O₂對小鼠原代胰腺腺泡細胞的細胞毒作用，然后在倒置顯微鏡的明場下進行觀察以確定H₂O₂對原代胰腺腺泡細胞的影響。