[發明專利]一種用于微衛星不穩定狀態的多重熒光檢測的引物設計方法、試劑盒

在審

• 申請號: 202211397132.3
• 申請日: 2022-11-09
• 公開（公告）號: CN116042787A
• 公開（公告）日: 2023-05-02
• 發明（設計）人: 郭亮
• 申請（專利權）人: 上海科醫聯創醫學檢驗實驗室有限公司
• 主分類號: C12Q1/6858
• 分類號: C12Q1/6858;C12Q1/6886;C12N15/11
• 代理公司: 寧波鄞州全方專利商標事務所(普通合伙) 33242
• 代理人: 樓瑜舟

一種用于微衛星不穩定狀態的多重熒光檢測的引物設計方法，需同時符合下述條件：1)包含5個單核苷酸位點NR?21、NR?24、BAT?25、BAT?26、MONO?27，和2個五核苷酸位點PentaC和PentaD；2)將7對核苷酸位點分成三組：第一組：NR?21、NR?24、MONO?27，對應的通用引物為N1，N1的上游引物5’端標記為FAM；第二組：BAT?25、PentaC，對應的通用引物為N2，N2的上游引物5’端標記引物標記為HEX；第三組：BAT?26、PentaD，對應的通用引物為N3，N3的上游引物5’端標記為TAMRA。本發明通過僅標記3條通用引物，就可以實現對7個檢測位點的有效區分的引物設計方法，并利用該引物設計方法制備的檢測試劑盒，使7個位點的區分度得到提高，避免了單一熒光標記對多位點區分差的問題。

技術領域

本發明涉及微衛星不穩定狀態的檢測引物的設計方法，尤其涉及用于微衛星不穩定狀態的多重熒光檢測的引物設計方法及其檢測試劑盒。

背景技術

微衛星(Microsatellite)，是基因組中的一類短串聯重復DNA序列，一般由1-6個核苷酸組成，呈串聯重復排列。人類基因組中有數以萬計的微衛星位點，這些微衛星位點近似均勻地分布在各個染色體上，所有的微衛星序列約占整個基因組的3％。與DNA中的其他區域相比，微衛星區域具有較高的突變率，其高突變率的直接表現是高度的多態性，即不同個體之間或正常組織與腫瘤組織之間，微衛星位點重復單元的重復次數存在差異，由于微衛星位點的分布廣泛性及高度多態性，微衛星常用于個體鑒定、連鎖圖譜的繪制以及腫瘤發生機制的研究。微衛星不穩定性(Microsatellite?Instability，MSI)是指：與正常組織相比，腫瘤中某個微衛星位點由于重復單元的插入或缺失而出現新的微衛星等位基因的現象。MSI的發生是由于腫瘤組織的DNA錯配修復出現功能性缺陷導致。伴隨著DNA錯配修復缺陷的MSI現象是臨床上的一項重要的腫瘤標志物。錯配修復蛋白包括MLH1,PMS2、MSH2、MSH6、MLH3、MSH3和PMS1等，這些蛋白可構成識別和修復DNA損傷的異質二聚體，經與核酸外切酶、增殖細胞核抗原和DNA聚合酶的共同作用修復MSI,其中與結直腸癌相關的錯配,修復蛋白異質二聚體是MLH1/PMS2和MSH2/MSH6。很多生長調控相關因子的基因中含有大量微衛星,錯配修復缺陷造成的MSI會引起DNA復制過程中發生突變,最后形成腫瘤。根據微衛星不穩定的程度，可以將MSI分為MSI-H(MicroSatellite?InstabilityHigh)，MSI-L(MicroSatellite?Instability?Low)以及MSS(MicroSatellite?Stable)。進一步的研究表明,很多腫瘤的發生如肺癌、食道癌、膀胱癌、胃癌、甲狀腺癌等均與微衛星不穩定性密切相關。在對多種癌組織進行微衛星不穩定性檢測后發現，其微衛星不穩定性的突變率明顯增高。在遺傳性非息肉性結直腸癌(HNPCC)中微衛星不穩定性的突變率可高達70-90％,散發性大腸癌微衛星不穩定性的突變率也高達28.85％。因此,微衛星不穩定性的檢測已經成為篩選惡性腫瘤的重要診斷指標。

1993年，Aaltonen等人首次在家族性遺傳性結直腸癌中發現高頻率的MSI。MSI在大約15％的結直腸癌以及90％的林奇綜合癥中起決定作用。近年來的研究表明，MSI對林奇綜合癥以及結直腸癌的診斷、預后以及化療敏感性有重要的意義，除了結直腸癌，也相繼在子宮內膜癌、卵巢癌、胃癌以及結直腸癌等多種癌癥中發現MSI。MSI作為腫瘤遺傳不穩定的敏感指標，其檢測對于腫瘤的早期診斷、預后判斷、化療敏感性判斷以及高危人群的圈定等具有重要意義。已有不少研究發現MSI-H的腫瘤患者相對于MSS的腫瘤患者有更好的預后，同時MSI-H腫瘤患者對不同化療方法的敏感性也表現出差異。

NCCN指南(結腸癌)中指出：所有結腸癌或直腸癌患者均應考慮進行MMR或MSI檢測確定是否為Lynch綜合征。MSI-H的II期結腸癌患者預后較好，并且不能從5-FU輔助化療獲益。所有轉移性結直腸癌也應該進行MMR或MSI檢測。2017年NCCN首次將腫瘤免疫檢查點抑制劑PD-1單抗Pembrolizumab和Nivolumab推薦用于具有dMMR/MSI-H分子表型的晚期結直腸癌患者的末線治療。