[發明專利]威尼斯鐮刀菌TB01的整合位點及其應用

在審

• 申請號: 202211384512.3
• 申請日: 2022-11-07
• 公開（公告）號: CN115786384A
• 公開（公告）日: 2023-03-14
• 發明（設計）人: 馬延和;童勝;李德茂;安可心;陳吳西;王欽宏;孫媛霞
• 申請（專利權）人: 中國科學院天津工業生物技術研究所
• 主分類號: C12N15/80
• 分類號: C12N15/80;C12N15/65;C12N15/31;C12Q1/6897;G01N21/64;C12R1/77
• 代理公司: 北京遠大卓悅知識產權代理有限公司 11369
• 代理人: 靳雪華

1.威尼斯鐮刀菌TB01的整合位點，其特征在于，包括兩個配套CRISPR/Cas9系統使用的整合位點，其分別位于：威尼斯鐮刀菌TB01的1號染色體FVRRES_00686基因上游5438bp處和威尼斯鐮刀菌TB01的1號染色體FVRRES_00686基因上游4499bp處。

2.根據權利要求1所述的威尼斯鐮刀菌TB01的整合位點，其特征在于，GFP表達盒在所述威尼斯鐮刀菌TB01上的插入位點為1號染色體FVRRES_00686基因上游4886bp處。

3.包含權利要求2所述的威尼斯鐮刀菌TB01的整合位點的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

4.向權利要求1所述的威尼斯鐮刀菌TB01的整合位點定點插入不同啟動子驅動下的GFP表達盒，其特征在于，含有用于GFP表達盒在威尼斯鐮刀菌TB01定點插入所需的CRISPR/Cas9表達載體和供體DNA。

5.向權利要求4所述的威尼斯鐮刀菌TB01的整合位點插入基因的方法，其特征在于，針對向威尼斯鐮刀菌TB01整合位點定向插入靶基因，構建包含CRISPR/Cas9序列和sgRNA序列的表達載體及相應的供體DNA片段，將權利要求4中所述的載體和供體片段轉化所述的威尼斯鐮刀菌TB01。

6.威尼斯鐮刀菌TB01的整合位點的鑒定方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1、通過原生質體轉化法將GFP表達盒導入到威尼斯鐮刀菌TB01中，獲得GFP表達文庫；

S2、從所述GFP表達文庫中篩選出中性插入且能夠高表達的熒光菌株；

S3、鑒定GFP表達盒在所述熒光菌株中的插入位點，其插入位點具體為1號染色體FVRRES_00686基因上游4886bp處；

S4、以步驟S3確定的插入位點為中心，選取其上下游各600bp區域作為候選序列，采用CRISPR/Cas9介導的基因同源定向重組插入；

S5、通過CRISPR/Cas9介導靶標基因對步驟S4中選取的候選序列進行整合效率、遺傳穩定性、菌株生長評估后，確認威尼斯鐮刀菌TB01的整合位點包括權利要求1所述的兩個整合位點。

7.威尼斯鐮刀菌TB01的整合位點在威尼斯鐮刀菌TB01基因工程中的應用。