[發明專利]基于豬繁殖與呼吸綜合征ORF2a基因的RT-RPA熒光型建立方法

在審

• 申請號: 202211383585.0
• 申請日: 2022-11-07
• 公開（公告）號: CN116121452A
• 公開（公告）日: 2023-05-16
• 發明（設計）人: 曹宗喜;陳素貞;劉光亮
• 申請（專利權）人: 海南省農業科學院畜牧獸醫研究所;海南省農業科學院三亞研究院（海南省實驗動物研究中心）
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6851;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 北京中安信知識產權代理事務所(普通合伙) 11248
• 代理人: 趙黎虹

本發明涉及基于豬繁殖與呼吸綜合征ORF2a基因的RT?RPA熒光型建立方法，采用的引物序列為：正向引物：AGCTTCACGATTTTCAGCAATGGCT；反向引物(5’?3’)：ACGTAGCATTGGAATTCGCAACCAC；探針(5’?3’)：5'?AATAGCTGTACATTCCTCCATATTTTCT(HEX?dT)C(THF)G(BHQ1?dT)TGCAGCTTCTTGT?C3Spacer。利用本發明設計的引物，RNA通過逆轉錄酶M?MLV逆轉錄成cDNA后，重組酶介導的擴增技術(RPA)擴增目標產物，并結合實時熒光定量PCR儀，可以實現PRRSV的快速、準確檢測。利用上述引物，待測樣品若存在PRRSV，則檢測結果出現擴增曲線，若待測樣品不存在PRRSV，則檢測結果不起峰；本發明方法操作快速，具有特異性強，靈敏度高。

技術領域

本發明涉及了檢測技術領域，具體的是基于豬繁殖與呼吸綜合征ORF2a基因的RT-RPA熒光型建立方法。

背景技術

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine?reproductive?and?respiratory?syndrome，PRRS)臨床癥狀表現為仔豬呼吸障礙、母豬繁殖障礙、肺部出血、免疫抑制等。豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine?reproductive?and?respiratory?syndrome?virus，PRRSV)是一種單股正鏈的RNA病毒，屬于套式病毒目動脈炎病毒科動脈炎病毒屬，根據基因型分為歐洲型(PRRSV-1)和美洲型(PRRSV-2)；PRRSV全長基因組大約在15kb左右，包含10個開放閱讀框(ORF)，編碼14個非結構蛋白和7個結構蛋白。病毒粒子為直徑大小在50-80nm之間的球形或橢圓形，具有囊膜且表面有微絨毛樣突起。

在早期對PRRS的監測和預防非常關鍵，而構建一種能夠快速檢測PRRSV的RT-RPA熒光型方法對PRRS的監測和預防具有重要意義。

RT-RPA是重組酶介導的擴增技術結合逆轉錄酶M-MLV及熒光定量PCR儀的檢測方法，RPA是在重組酶介導聚合酶在等溫條件下對目標序列進行擴增的等溫擴增技術，RNA在逆轉錄酶M-MLV作用下反轉成cDNA，DNA/cDNA能夠在短時間內擴增10⁹-10¹²倍，擴增產物所帶的熒光基團釋放熒光信號，根據擴增產物的濃度及熒光信號強度顯示出不同程度的擴增曲線，且擴增曲線在15min內起峰均判斷為陽性。RPA恒溫擴增技術在各行業已成為熱點，熒光定量PCR儀在食品安全監測、人畜病害防治、植物病害診斷等領域廣泛應用，許多豬養殖場也配備了熒光定量PCR儀。

由于PRRSV?ORF2a能夠編碼次要結構蛋白GP2a，該蛋白在病毒侵入結合受體時起到關鍵作用，因此根據ORF2a序列相對保守區域設計正反向引物及探針，構建PRRSV?ORF2a序列的RT-RPA熒光型檢測方法，快速高效的對PRRS監測、防控，有利于維持豬種群的健康和豬養殖業的穩定發展。

發明內容

本發明涉及的一種用于檢測PRRSV的RT-RPA熒光型引物和探針，包括RPA-ORF2a引物對和RPA-ORF2a探針，其特征在于，所述RPA-ORF2a引物對的上游引物核苷酸序列為：5'-AGCTTCACGATTTTCAGCAATGGCT-3'，下游引物核苷酸序列為：5'-ACGTAGCATTGGAATTCGCAACCAC-3'；

所述RPA-ORF2a探針為，

5'-AATAGCTGTACATTCCTCCATATTTTCT(HEX-dT)C(THF)G(BHQ1-dT)TGCAGCTTCTTGT-C3?Spacer。

本發明還提供一種檢測PRRSV的RT-RPA擴增試劑，所述的RT-RPA擴增試劑包括上述引物和探針。

進一步地，所述RT-RPA擴增試劑還包括PrimerFree?RehydrationBuffer、DEPC處理水和DNA/RNA樣本。