[發明專利]一種快速鑒定耐碳青霉烯肺炎克雷伯桿菌的方法

在審

• 申請號: 202211380156.8
• 申請日: 2022-11-05
• 公開（公告）號: CN115678958A
• 公開（公告）日: 2023-02-03
• 發明（設計）人: 袁有華;趙高嶺;李越峰;李軼;王山梅;許俊紅;馬冰;荊楠;張江峰;閆文娟;王保亞;張琦;楚亞菲;馬瓊;徐文博;楊文寧
• 申請（專利權）人: 河南省人民醫院
• 主分類號: C12Q1/04
• 分類號: C12Q1/04;C12Q1/686;C12Q1/689;G01N33/68;G01N27/64;G16B35/20;G16B25/20;G16B50/00;C12R1/22
• 代理公司: 鄭州知勁專利代理事務所(普通合伙) 41193
• 代理人: 韓松

本發明屬于耐藥菌鑒定技術領域，具體涉及一種快速鑒定耐碳青霉烯肺炎克雷伯桿菌的方法，包括建庫用耐碳青霉烯和敏感碳青霉烯肺炎克雷伯菌的篩選、耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌的耐藥基因檢測、質譜樣品制備、蛋白質譜條帶差異、建立不同肺炎克雷伯菌菌株的蛋白質譜條帶差異數據庫、用建立的質譜數據庫進行臨床鑒定。本發明質譜鑒定耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌的準確率為81.5%，鑒定一株細菌的平均時間為0.5分鐘，鑒定20株細菌的平均鑒定時間為10分鐘。

技術領域

本發明屬于耐藥菌鑒定技術領域，具體涉及一種快速鑒定耐碳青霉烯肺炎克雷伯桿菌的方法。

背景技術

當前，抗生素濫用而導致的耐藥細菌的出現正成為全球共同面臨的一大嚴峻危機。世界衛生組織的有關資料顯示，每年全球死于抗生素耐藥的約有70萬人。另據英國抗菌藥物評估委員會估計，到2050年，全球將有1000萬人遭遇抗生素耐藥問題。針對耐藥細菌的問題，2017年世界衛生日主題為“控制細菌耐藥，今天不采取行動，明天將無藥可用”。在世界衛生組織認為急需開發新抗生素的12種重點耐藥性細菌中，耐碳青霉烯類抗生素的腸桿菌類包括肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞及鮑氏不動桿菌為第一隊列，在需要新抗生素的迫切度上最高。

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，KPn）是一種發酵的革蘭氏陰性桿菌，為醫院獲得性感染的主要條件性致病菌之一。器官移植、燒傷、免疫系統受到抑制及重癥監護室的患者均極易感染肺炎克雷伯菌，增加發病率和死亡率。碳青霉烯類藥物是非典型的β-內酰胺類抗菌藥物，抗菌作用較強，對超廣譜β-內酰胺酶（extended spectrum betalactamase，ESBLs）和持續高產C類頭孢菌素酶（ample cephalosporinase，AmpC）等多種β-內酰胺酶穩定，是醫院嚴重感染的經驗性治療藥物之一，臨床應用逐漸增多。但近些年細菌對該類藥物的耐藥增加，尤其是肺炎克雷伯菌，耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌在很多國家均流行。2003至2017年，國內13家教學醫院耐藥監測結果顯示，美羅培南的耐藥率由13%增長至25%；亞胺培南的耐藥率也略有增長，維持在25%～30%；還存在一定比例的多重耐藥肺炎克雷伯菌。根據我國最大的耐藥監測網絡CHINET數據，全國耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌（Carbapeneme resistant Klebsiella pneumoniae，CRKP）比例從2000年的0.9%上升至2016年的8.7%。而在河南省，2016年度碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌的比例為23.2%，占據全國各省份的第二。本申請人單位2016年度血培養中檢出的細菌中，肺炎克雷伯菌占第1位。

在近期，泛耐藥高毒力的肺炎克雷伯桿菌院內感染暴發案例已經報道多起，而且存在散發的泛耐藥高毒力肺炎克雷伯菌，院內感染暴發易發生在燒傷病房、ICU及神經外科等危重病人集中的病房，如果沒有及時發現及處理，容易造成危重病人的高死亡率。因此，及時識別診斷泛耐藥高毒力肺炎克雷伯菌，對臨床合理應用抗菌藥物及預防院內感染暴發具有重要的意義。傳統的微生物鑒定方法主要是基于表型的檢測，包括革蘭染色、微生物培養和生化試驗、藥敏試驗等，往往耗時較長，需要至少72小時才能將結果反饋臨床。

基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（matrix- assisted laser desorptionionization- time of flight MAs spectrometry，MALDI-TOF MS）是近年發展起來的一種新型的細菌鑒定技術，不僅可以在10分鐘內快速準確鑒定細菌，還可用于一些無菌樣本如血液和尿液的直接鑒定，極大地縮短了檢測時間至一小時。其原理是將檢測樣品與基質溶液混合或分別點加在樣品靶上，溶劑揮發后形成樣品與基質的共結晶；利用激光作為能量來源輻射結晶體，基質從激光中吸收能量使樣品解吸，基質與樣品之間發生電荷轉移使得樣品分子電離，經過飛行時間檢測器，以質譜峰為縱坐標，質荷比(m/z)為橫坐標，形成質量圖譜；通過軟件分析比較，篩選并確定出特異性圖譜，從而實現對目標微生物的區分和鑒定。各類細菌經MALDI-TOF- MS檢測可以形成特異性的指紋圖譜，只要建立這些細菌的圖譜庫，將待測細菌的質譜圖與圖譜庫進行比較，就可確定細菌種屬。