[發(fā)明專利]一種耐高滲透壓菌種篩選方法及在谷氨酸發(fā)酵中的應用

在審

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• 申請日: 2022-11-04
• 公開（公告）號: CN116286584A
• 公開（公告）日: 2023-06-23
• 發(fā)明（設計）人: 龍泉偉;李必金;程國平;楊帆;張金龍;李巖
• 申請（專利權(quán)）人: 吉林梅花氨基酸有限責任公司
• 主分類號: C12N1/36
• 分類號: C12N1/36;C12N1/20;C12P13/14;C12R1/15
• 代理公司: 北京棘龍知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11740
• 代理人: 徐夢依

本發(fā)明提出了一種耐高滲透壓菌種篩選方法及在谷氨酸發(fā)酵中的應用，屬于發(fā)酵工程技術領域。包括以下步驟：(1)菌種活化；(2)菌種種子液的制備；(3)初次傳代馴化；(4)二次傳代馴化；(5)平板初篩；(6)搖瓶復篩；最后將獲得的菌種應用于谷氨酸發(fā)酵過程中，總投糖提高了22?25％，理論酸提高了22?25％。本發(fā)明菌種篩選方法解決了工業(yè)生產(chǎn)中菌種在高滲透壓條件下耗糖慢、產(chǎn)量低的問題。

技術領域

本發(fā)明涉及發(fā)酵工程技術領域，具體涉及一種耐高滲透壓菌種篩選方法及在谷氨酸發(fā)酵中的應用。

背景技術

L-谷氨酸(L-glutamate)，化學名稱為α-氨基戊二酸，分子式為C₅H9NO₄，分子量為147.13076，分子中含有兩個羧基，是一種酸性氨基酸。廣泛應用于食品、醫(yī)藥、日化及飼料等工業(yè)領域。

谷氨酸目前的生產(chǎn)方法是發(fā)酵法生產(chǎn)，微生物合成谷氨酸途徑是葡萄糖經(jīng)過糖酵解途徑(EMP)和磷酸己糖支路(HMP)生成丙酮酸，丙酮酸脫羧生成乙酰輔酶A；然后在醛縮酶的催化下，草酰乙酸和乙酰輔酶A合成檸檬酸，進一步生成異檸檬酸和α-酮戊二酸，α-酮戊二酸在谷氨酸脫氫酶及NH₄⁺存在下生成谷氨酸，菌體內(nèi)合成的谷氨酸透過細胞膜，便能在發(fā)酵液中積累大量的谷氨酸。

目前影響谷氨酸行業(yè)發(fā)展的主要問題是使用的谷氨酸生產(chǎn)菌株隨著工藝技術的不斷優(yōu)化提升，生產(chǎn)過程中發(fā)酵液的谷氨酸濃度不斷提高，滲透壓也不斷升高，從而抑制菌體活性，導致發(fā)酵中后期耗糖、產(chǎn)酸能力下降。目前常用的方法包括從工藝出發(fā)通過加入滲透壓調(diào)節(jié)物質(zhì)甜菜堿等維持胞內(nèi)離子平衡從而緩解滲透壓升高對菌體活性的抑制；也有通過半連續(xù)或連續(xù)發(fā)酵工藝來減緩發(fā)酵過程中滲透壓的升高；也有從菌種出發(fā)，通過傳統(tǒng)的誘變育種或者分子改造方法以提高菌種的抗逆能力。由于谷氨酸棒桿菌抵御高滲透壓脅迫的潛在機制還不清晰，因此還沒有特定的分子改造靶點，同時采用傳統(tǒng)的誘變育種方法是隨機突變，篩選難度大，無法定向獲得耐滲菌株。

最接近現(xiàn)有技術：

中國專利CN101705262A公開了一種利用甜菜堿提高谷氨酸溫度敏感突變株發(fā)酵產(chǎn)酸率的新工藝。本發(fā)明涉及一種利用溫度敏感突變株發(fā)酵生產(chǎn)L-谷氨酸的改進方法。本發(fā)明根據(jù)甜菜堿在谷氨酸發(fā)酵過程中具有提供甲基、調(diào)節(jié)菌體細胞內(nèi)滲透壓、促進菌體脂肪代謝和蛋白質(zhì)合成等作用，可提高菌體內(nèi)酶活，促進菌體生長，實現(xiàn)谷氨酸在發(fā)酵液中的更大程度蓄積從而提高產(chǎn)率的原理，采用在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加甜菜堿或磷酸鹽甜菜堿的方法，來有效提高L-谷氨酸發(fā)酵產(chǎn)率。

中國專利CN111621530A公開了一種半連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酸的方法及系統(tǒng)，種子培養(yǎng)；溫敏谷氨酸菌種在30-32℃、pH7.0-7.1條件下培養(yǎng)制備菌種種子液；發(fā)酵培養(yǎng)：菌種種子液接入培養(yǎng)基中，采用半連續(xù)式發(fā)酵，在發(fā)酵過程中流加補料。本發(fā)明采用的利用溫敏谷氨酸半連續(xù)發(fā)酵工藝能夠延長谷氨酸產(chǎn)酸周期，避免了發(fā)酵液中谷氨酸積累對菌體的抑制作用，及提高發(fā)酵液中氧、營養(yǎng)素傳遞速率，與現(xiàn)有發(fā)酵工藝相比，能夠整體縮短發(fā)酵周期，提高發(fā)酵效率，同時單罐發(fā)酵液谷氨酸含量得到了極大的提升。

中國專利CN113981019A公開了一種提高谷氨酸發(fā)酵速率的工藝，其包括如下步驟：將溫度敏感型谷氨酸棒桿菌菌種種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，2h開始流加體積分數(shù)為60％的全營養(yǎng)培養(yǎng)基，持續(xù)流加24h，停止流加，發(fā)酵總時間為28-32h；從發(fā)酵12h時進行放料直至發(fā)酵結(jié)束，放料速度與流加培養(yǎng)基的速度保持一致。本發(fā)明能夠提升發(fā)酵速率、提高單罐發(fā)酵產(chǎn)能、降低發(fā)酵過程中能物耗消耗。

中國專利CN111088203A公開了一種產(chǎn)賴氨酸的重組谷氨酸棒桿菌及其構(gòu)建方法和應用，通過在谷氨酸棒桿菌中過表達ADP葡萄糖焦磷酸化酶，提高了糖原合成速度，使得谷氨酸棒桿菌得以快速響應高滲脅迫，從而提高了谷氨酸棒桿菌生長速度和賴氨酸產(chǎn)量，縮短了發(fā)酵周期。

發(fā)明內(nèi)容