[發明專利]適用于中通量核酸空間位置信息的檢測方法及其應用

在審

• 申請號: 202211334802.7
• 申請日: 2022-10-28
• 公開（公告）號: CN115449540A
• 公開（公告）日: 2022-12-09
• 發明（設計）人: 曹罡;戴金霞;王忠超;楊莉瑤;吳小鳳;徐偉澤;李月;蔡懷源;高安然
• 申請（專利權）人: 華中農業大學;鯤羽生物科技（江門）有限公司
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12Q1/682;C12Q1/6886;C12Q1/6883;C12Q1/6888
• 代理公司: 武漢開元知識產權代理有限公司 42104
• 代理人: 馮超

本發明公開了一種適用于中通量核酸空間位置信息的檢測方法及其應用，該方法首先設計出初級雜交探針，根據待檢測細胞或組織的核酸種類數，設計Y×N條次級雜交探針，所述次級雜交探針與初級雜交探針中的鎖式探針的部分區域互補連接；其中，Y×N數值需滿足待檢測細胞或組織的核酸種類數，進行N輪的熒光探針與靶基因雜交，解讀每個組合兩種熒光的共定位，確定空間上不同種類核酸分子的分布，該方法可通過N輪的雜交，達到了同時檢測最多種核酸分子的目的，且信號強度高，信號的解讀不依賴超分辨成像平臺，實現了檢測成本、檢測輪數、檢測通量和信號強度之間的平衡，推動了原位空間轉錄組的普及和發展。

技術領域

本發明涉及原位雜交領域，具體涉及一種適用于中通量核酸空間位置信息的檢測方法及其應用。

背景技術

從1975年第一代測序技術的發明到2005年起二代測序技術的興起，核酸測序獲得的海量數據推動了生命科學的高速發展。而對核酸的檢測方法也不斷進步，單細胞測序技術的發明實現了在單個細胞水平上對轉錄組或基因組進行擴增并測序，但是難以獲取核酸分子在空間位置上的分布信息。研究表明，核酸分子在組織和細胞的空間分布與功能緊密聯系，在空間水平檢測核酸分子具有重要意義。

目前主流的原位空間組學檢測方法有單分子熒光原位雜交(smFISH)、序貫熒光原位雜交(seqFISH)、雜交鏈式反應(HCR)以及STARmap(Spatially-resolved TranscriptAmplicon Readout Mapping)等。但目前的方法仍然存在下列問題：

1.smFISH被認為是核酸檢測的行業標準，其原理是直接使用熒光標記的探針對RNA進行原位雜交。該類方法的成像需要針對每個基因設計至少24個熒光探針，而且由于未對信號進行放大，其檢測需要借助于超分辨熒光顯微鏡，對技術要求和成均有較高要求，此外此類方法難以進行高通量檢測。

2.seqFISH技術的技術特點是通過對基因預先進行N位的編碼，隨后在1～N輪雜交過程中呈現每個基因的1～N輪編碼，進一步識別不同的核酸分子。該方法具有通量高、檢測效率高的優點，但是與smFISH類似，該方法也需要借助超分辨顯微鏡，且需要繁瑣的多輪雜交和成像，成本相對較高。

3.STARmap運用鎖式探針對核酸分子結合，然后通過滾環擴增的方式對雜交的信號進行放大，進一步用原位測序的方法來展示空間轉錄組，通過連接測序的方式對探針序列進行解讀。該方法的優勢是檢測通量高、信號強度高，可運用普通共聚焦進行成像，但是該方法相對基于雜交的檢測方法而言效率較低，通過連接測序的方法耗時較長。

發明內容

本發明針對現有技術顯微鏡單次只能分辨有限的標記種類(Y種)，而傳統方法通過標記探針逐輪檢測在N輪以后只能識別Y×N種核酸分子，連接測序耗時長和直接雜交信號強度低的缺陷，提供了一種適用于中通量核酸空間位置信息的檢測方法，本發明兼顧技術難度、檢測成本和檢測通量，基于滾環擴增(RCA)放大信號，通過在Y×N種次級探針中選取不重復的M種作為一個組合用以標記一類核酸分子，進行N輪的熒光探針與靶基因雜交，解讀每個組合M種標記的共定位(即一類核酸分子)，進一步可以確定空間上不同種類核酸分子的分布，該方法可通過N輪的雜交，達到了同時檢測最多種核酸分子的目的，且信號強度高，信號的解讀不依賴超分辨成像平臺，實現了檢測成本、檢測輪數、檢測通量和信號強度之間的平衡，推動了原位空間轉錄組的普及和發展。

為實現上述目的，本發明所設計一種適用于中通量核酸空間位置信息的檢測方法，包括以下步驟：

1)初級雜交探針的設計

從待檢測細胞或組織的核酸序列中篩選出雜交效率高、特異性強、無RNA高級結構的靶序列區域，并將設計出初級雜交探針，其中，所述初級雜交探針由鎖式探針和RCA引發探針組成；

2)次級雜交探針(次級雜交探針為攜帶特殊標記的脫氧核糖核酸序列)的設計