[發明專利]一種甘蔗抗條紋花葉病毒的精準評價方法

在審

• 申請號: 202211328783.7
• 申請日: 2022-10-27
• 公開（公告）號: CN115449564A
• 公開（公告）日: 2022-12-09
• 發明（設計）人: 王文治;馮小艷;張樹珍;王俊剛;馮翠蓮;趙婷婷;沈林波
• 申請（專利權）人: 中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6851;C12N15/11;C12Q1/6895;C12Q1/686;A01H4/00;A01G7/00;C12R1/94
• 代理公司: 深圳市千納專利代理有限公司 44218
• 代理人: 張新蕊

1.一種甘蔗抗條紋花葉病毒的精準評價方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)篩選感染單一SCSMV株系甘蔗材料；

(2)待評價甘蔗種質無毒植株制備：截取待評價的甘蔗種質植株頂端生長點處的幼葉組織為外植體，消毒后，通過愈傷誘導及脫分化培養獲得組培苗，室溫練苗后，溫室培養，選取長勢較一致的植株，通過病毒檢測最終獲得長勢一致的甘蔗種質無毒幼嫩植株；

(3)SCSMV病原液制備：從感染單一SCSMV株系甘蔗材料中提取獲得SCSMV病原液；

(4)甘蔗種質無毒植株SCSMV病原接種：將等量SCSMV病原液分別接種至步驟(2)獲得的無毒幼嫩植株上；

(5)篩選出感染SCSMV的甘蔗植株；

(6)SCSMV熒光定量PCR標準曲線構建

對含SCSMV病毒的cDNA模板進行擴增，將PCR產物克隆至pMD19-T載體，轉化DH5α感受態細胞，構建重組質粒pMD19T-SCSMV。提取pMD19T-SCSMV質粒，測定濃度并計算其拷貝數；將梯度稀釋的重組質粒標準品作為模板，進行實時熒光定量PCR反應，通過質粒模板不同濃度梯度的擴增曲線，得到擴增CT值與單位體積樣品的病毒載量線性關系的標準曲線；

(7)不同甘蔗種質SCSMV定量檢測

采集步驟(5)篩選出感染SCSMV的甘蔗植株葉片組織，分別提取總RNA，逆轉錄為cDNA，并以cDNA為模板進行實時熒光定量PCR檢測，并通過構建的標準曲線，精準測定不同甘蔗種質甘蔗葉片單位體積SCSMV積累量，形成對不同甘蔗種質對SCSMV的抗感差異精準比較分析。

2.根據權利要求1所述的甘蔗抗條紋花葉病毒的精準評價方法，其特征在于，熒光定量PCR所用引物對為：SCSMV-qF：CTCACGCCAAAGTAAGTCAA和SCSMV-qR：TGCTGTTCGAGTTACGATTC。

3.根據權利要求1所述的甘蔗抗條紋花葉病毒的精準評價方法，其特征在于，標準曲線方程為y＝-3.392×LOG(x)+40.19，其中，y為熒光定量PCR擴增的CT值，代表PCR擴增的循環數，單位cycles，LOG(x)為以10為底x的對數，x為質粒的拷貝數，單位copies。

4.根據權利要求1所述的甘蔗抗條紋花葉病毒的精準評價方法，其特征在于，步驟(1)為：采集花葉病癥狀明顯的甘蔗植株葉片，提取葉片總RNA，通過甘蔗花葉病毒(SCMV)、高粱花葉病毒(SrMV)和甘蔗條紋花葉病毒(SCSMV)的特異性檢測引物進行檢測鑒定，篩選出只感染SCSMV的甘蔗植株；優選地，還對只感染SCSMV的甘蔗植株PCR檢測產物進行高通量測序，確保無不同SCSMV株系混合感染的情況；進一步優選地，用防蟲網保護只感染SCSMV的甘蔗植株。

5.根據權利要求1所述的甘蔗抗條紋花葉病毒的精準評價方法，其特征在于，步驟(2)中通過甘蔗花葉病毒(SCMV)、高粱花葉病毒(SrMV)和甘蔗條紋花葉病毒(SCSMV)的特異性檢測引物進行檢測鑒定最終獲得長勢一致的甘蔗種質無毒幼嫩植株。

6.根據權利要求1所述的甘蔗抗條紋花葉病毒的精準評價方法，其特征在于，步驟(4)接種時采取對甘蔗最靠近芯葉能看見肥厚帶的葉片進行多個位點的擦傷接種；優選地，在病原液中加入等量石英砂，拇指和食指蘸取病原液，搓揉植株最靠近芯葉能看見肥厚帶的葉片基部至表皮擦傷，接種完后覆膜或套塑料袋保濕；進一步優選地，間隔7天左右對新長出的完整的最靠近芯葉能看見肥厚帶的葉片進行擦傷接種，接種2-4次。