[發明專利]一種冬蟲夏草的指紋圖譜構建方法及應用

在審

• 申請號: 202211328433.0
• 申請日: 2022-10-27
• 公開（公告）號: CN115684404A
• 公開（公告）日: 2023-02-03
• 發明（設計）人: 龍海林;饒中臣;吳華;劉桂清;曹莉;韓日疇
• 申請（專利權）人: 廣東省科學院動物研究所
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06;G01N30/08;G01N30/12;G01N30/14;G01N30/30;G01N30/32;G01N30/34;G01N30/74;G01N30/86
• 代理公司: 廣州科粵專利商標代理有限公司 44001
• 代理人: 朱聰聰;劉明星

1.一種冬蟲夏草的指紋圖譜構建方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)供試品溶液制備：取冬蟲夏草藥材，粉碎后加入正己烷超聲提取，正己烷提取液先后用酸性和堿性無機鹽溶液萃取，萃取后的正己烷提取液濃縮，用固相萃取柱吸附后洗脫，分離出甾醇類成分，收集并合并洗脫液，洗脫液回收溶劑后用甲醇-異丙醇混合溶劑溶解，用微孔濾膜過濾除菌，得到供試品溶液；

(2)對照品溶液制備：取對照品麥角甾醇、膽甾醇和谷甾醇，分別加入甲醇-異丙醇混合溶劑溶解后得對照品儲備液，將三種對照品儲備液以一定的體積混合均勻，用微孔濾膜過濾除菌，得到對照品混合溶液；

(3)參照物溶液制備：取冬蟲夏草對照藥材，粉碎后加入無水乙醇超聲提取，提取液濃縮后加入甲醇-異丙醇混合溶劑溶解，用微孔濾膜過濾除菌，得到參照物溶液；

(4)高效液相色譜檢測，制定冬蟲夏草甾醇類成分的指紋圖譜。

2.根據權利要求1所述的冬蟲夏草的指紋圖譜構建方法，其特征在于，所述步驟(4)中高效液相色譜檢測的色譜條件為：

色譜柱：C18色譜柱；

流動相：以超純水為流動相A，以甲醇為流動相B進行梯度洗脫，所述流動相梯度洗脫條件為：0～7min，流動相中A(65％→20％)，流動相B(35％→80％)；7～15min，流動相中A(20％→0％)，流動相B(80％→100％)；15～30min，流動相中A(0％→0％)，流動相B(100％→100％)；30～35min，流動相中A(0％→35％)，流動相B(100％→65％)；35～40min，流動相中A(35％→35％)，流動相B(65％→65％)；

檢測波長：216nm；

流速：0.5ml/min；

柱溫：30℃；

分別精密吸取對照品混合溶液5μl、參照物溶液和供試品溶液各15μl，注入高效液相色譜儀，測定。

3.根據權利要求1或2所述的冬蟲夏草的指紋圖譜構建方法，其特征在于，所述步驟(4)中制定冬蟲夏草甾醇類成分指紋圖譜的方法為：通過對照品溶液、參照物溶液和供試品溶液色譜圖中的色譜峰出峰時間和色譜峰是否存在進行比較，得出供試品溶液中的共有特征峰。

4.根據權利要求3所述的冬蟲夏草的指紋圖譜構建方法，其特征在于，所述冬蟲夏草甾醇類成分指紋圖譜包括12個共有特征峰，其中，9號峰為麥角甾醇，11號峰為膽甾醇，12號峰為谷甾醇，其它為未知成分峰；

以麥角甾醇9號峰為參照峰，各特征峰的相對保留時間為：1號峰：0.579±0.029；2號峰：0.672±0.034；3號峰：0.756±0.038；4號峰：0.794±0.040；5號峰：0.814±0.041；6號峰：0.850±0.042；7號峰：0.936±0.047；8號峰：0.949±0.047；9號峰：1.000±0.05；10號峰：1.016±0.051；11號峰：1.063±0.053；12號峰：1.169±0.058。

5.根據權利要求1或2所述的冬蟲夏草的指紋圖譜構建方法，其特征在于，所述步驟(1)中，冬蟲夏草藥材粉碎至約10目，每克冬蟲夏草按照以下方法處理：冬蟲夏草藥材與正己烷的質量體積比為1.0g：100ml，超聲提取使用的功率為400W，工作頻率為40KHz，提取時間為30min；酸性無機鹽溶液為質量體積比為1％g/ml的磷酸二氫鈉水溶液，堿性無機鹽溶液為質量體積比為1％g/ml的磷酸氫二鈉水溶液，酸性和堿性無機鹽溶液分別萃取1次；經酸性和堿性無機鹽溶液萃取的正己烷提取液濃縮至2ml，固相萃取柱為C18柱，固相萃取柱先用3ml正己烷活化，然后依次用3ml的正己烷(Ⅰ)、正己烷-二氯甲烷(Ⅱ，1:1v/v)、二氯甲烷(Ⅲ)、二氯甲烷-甲醇(Ⅳ，1:1v/v)、甲醇(Ⅴ)洗脫，收集洗脫液Ⅱ和Ⅲ，回收溶劑后用2ml甲醇-異丙醇混合溶劑溶解，甲醇-異丙醇混合溶劑的體積比為1:1，用微孔濾膜過濾，得到供試品溶液。