[發明專利]一種納米孔測序用測序接頭的設計及應用

有效

• 申請號: 202211320707.1
• 申請日: 2022-10-26
• 公開（公告）號: CN115747211B
• 公開（公告）日: 2023-10-24
• 發明（設計）人: 馬敬芝;張童童
• 申請（專利權）人: 北京普譯生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/6806;C12Q1/6869
• 代理公司: 北京知元同創知識產權代理事務所(普通合伙) 11535
• 代理人: 劉元霞

1.一種用于表征靶多核苷酸的接頭，所述接頭含有四段區域：第一區段為用于引導待測 核酸進入納米孔的單鏈核苷酸區域，第二區段為多核苷酸結合蛋白結合區域，第三區段為阻 滯多核苷酸結合蛋白前進的銜接子區域，第四區段為用于連接靶多核苷酸的區域，在所述第 一區段，設有可形成i-motif二級結構的核酸片段，該片段可依賴pH值的不同，呈現單鏈或 i-motif狀態。

2.根據權利要求1所述的接頭，其中所述可形成i-motif二級結構的核酸片段為兩個或多 個。

3.根據權利要求2所述的接頭，其中所述兩個或多個可形成i-motif二級結構的核酸片段 為簡單的重復單元，或為不同片段的組合。

4.根據權利要求1-3任一所述的接頭，其中所述可形成i-motif二級結構的核酸片段為人 端粒i-motif序。

5.根據權利要求3或4所述的接頭，其中所述第二區段和第三區段為同一區段。

6.根據權利要求1或2所述的接頭，其中所述第四區段為連接靶多核酸的雙鏈區域。

7.根據權利要求1或2所述的接頭，其中所述第四區段為連接靶多核酸的單鏈區域。

8.一種用于表征靶多核苷酸的構建體，其中，所述構建體包含靶多核苷酸和權利要求1-7 中任一項所述的接頭，其中所述接頭與所述靶多核苷酸的任一端或兩端連接。

9.一種用于表征靶多核苷酸的復合物，其中，所述復合物包含多核苷酸結合蛋白，和權利要求1-7中任一所述的接頭或權利要求8所述的構建體；

優選地，所述多核苷酸結合蛋白衍生自多核苷酸處理酶；所述多核苷酸處理酶選自聚合 酶、解旋酶或核酸外切酶。

10.一種構建測序復合物的方法，所述方法包括：

1)構建含有可形成i-motif二級結構的核酸片段作為引導序列的接頭；

2)將所述接頭與待測核酸片段或靶核酸組裝形成構建體；

3)任選在步驟2)之前或之后，在引導序列形成i-motif狀態的條件下，將所述接頭或構建體與多核苷酸結合蛋白結合形成復合物，優選所述形成i-motif狀態的條件為弱酸性，進一 步優選所述弱酸條件為pH6。

11.根據權利要求10所述的方法，其中所述接頭如權利要求1-7中任一項所定義。

12.根據權利要求10或11所述的方法，其中所述復合物結合1個所述多核苷酸結合蛋白；

優選地，所述多核苷酸結合蛋白衍生自多核苷酸處理酶；所述多核苷酸處理酶選自聚合 酶、解旋酶或核酸外切酶。

13.一種控制靶多核苷酸穿過跨膜孔的移動的方法，所述方法包括：

(a)實施權利要求10至12中任一項所述的方法；

(b)在引導序列形成單鏈的條件下，將步驟(a)中提供的裝載有所述多核苷酸結合蛋白的靶 多核苷酸與所述跨膜孔接觸，所述形成單鏈的條件為中性條件或弱堿性條件，優選為pH8.0；

以及

(c)跨所述跨膜孔施加電勢，使得所述多核苷酸結合蛋白移動穿過接頭中阻滯多核苷酸結 合蛋白前進的銜接子區域，并控制所述靶多核苷酸穿過所述跨膜孔的移動。

14.根據權利要求13所述的方法，其中所述方法包括提供系鏈用于使所述構建體靠近所 述跨膜孔；所述系鏈包括捕獲區和錨定區，所述捕獲區用于捕獲所述構建體的接頭，所述錨 定區用于與所述跨膜孔或所述跨膜孔所在的膜錨定結合。