[發(fā)明專利]一種標(biāo)記同位素的外泌體及標(biāo)記方法和應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202211317715.0
• 申請日: 2022-10-26
• 公開（公告）號: CN115478042A
• 公開（公告）日: 2022-12-16
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 金倞;雷欣華;梁磊;高雷
• 申請（專利權(quán)）人: 北京吉中科生物技術(shù)有限公司
• 主分類號: C12N5/00
• 分類號: C12N5/00;C12N5/0775;A61K51/12;A61K103/00
• 代理公司: 北京高沃律師事務(wù)所 11569
• 代理人: 蘇士瑩

本發(fā)明屬于外泌體應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種標(biāo)記同位素的外泌體及標(biāo)記方法和應(yīng)用。本發(fā)明利用鐵載體衍生的螯合物去鐵氧胺，外泌體表面可以很容易被放射性同位素標(biāo)記。本發(fā)明所述方法普遍適用于長期體內(nèi)PET成像，同時還可應(yīng)用于評估GMP級治療性外泌體的臨床前生物分布和組織藥代動力學(xué)研究。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于外泌體應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種標(biāo)記同位素的外泌體及標(biāo)記方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

近幾十年來，納米醫(yī)學(xué)領(lǐng)域在各種疾病的治療應(yīng)用中發(fā)展迅速。外泌體是單層磷脂雙分子層組成的膜性囊泡，其顆粒大小一般為50～150nm。外泌體存在于幾乎所有體液中，因可運輸各種生物活性分子，如DNA、RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等，進(jìn)行細(xì)胞間信號激活和物質(zhì)交換，在生物相容性、低免疫原性和高效細(xì)胞內(nèi)傳遞等方面具有顯著優(yōu)勢，在臨床診斷和治療應(yīng)用方面受到越來越多的關(guān)注。

外泌體繼承了許多其親代細(xì)胞生理特性，可作為無細(xì)胞治療藥物，與細(xì)胞治療相比，外泌體具有更好的交付性和安全性。通過工程化外泌體或產(chǎn)生外泌體的細(xì)胞，將外泌體作為藥物遞送載體，以促進(jìn)機(jī)體有效地吸收活性藥物成分，已經(jīng)進(jìn)行了大量的研究和商業(yè)產(chǎn)品開發(fā)。大約有50項臨床試驗評估了天然或工程外泌體在不同治療領(lǐng)域的安全性和有效性。為了開發(fā)新的治療模式，確定各種動物模型的生物分布和藥代動力學(xué)特征對成功的臨床轉(zhuǎn)化至關(guān)重要。

外泌體已被報道主要分布于肝臟和脾臟，少量分布于腎臟、肺和胃腸道；然而，外泌體的分布可受多種因素的影響，如外泌體的細(xì)胞來源和外泌體膜的組成(如表面蛋白、脂質(zhì)和聚糖)。此外，外泌體的表面可以進(jìn)一步設(shè)計，誘導(dǎo)靶向傳遞到所需的細(xì)胞或器官，包括大腦、胎盤、心臟、脊髓和軟骨。在肝臟和脾臟等組織中觀察到外泌體滯留時間延長，其持續(xù)滯留時間超過24h。

然而，分析外泌體的組織藥代動力學(xué)(PK)需要更加詳盡的解釋，因為大多數(shù)外泌體成像技術(shù)使用的方法是用各種成像染料標(biāo)記外泌體的脂質(zhì)雙分子層，這可能導(dǎo)致跟蹤細(xì)胞攝取的磷脂而不是外泌體本身。給予外泌體可以引起快速血液清除，在健康動物中半衰期不到幾分鐘，這主要是由于單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)(如巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞)的快速清除，因此為推進(jìn)外泌體治療的臨床應(yīng)用進(jìn)展，亟需構(gòu)建一種真實表征外泌體的定量分布及組織藥代動力學(xué)的新標(biāo)記方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種標(biāo)記同位素的外泌體及標(biāo)記方法和應(yīng)用，建立一種使用放射性同位素標(biāo)記外泌體的方法，以確定外源性外泌體在各種動物模型中的生物分布和藥代動力學(xué)(PK)特征，通過質(zhì)量控制，可最小化外泌體異質(zhì)性導(dǎo)致的批次間差異。

本發(fā)明提供了一種利用放射性同位素標(biāo)記外泌體表面的方法，包括利用去鐵氧胺對外泌體進(jìn)行修飾，得DFO-外泌體；

利用含放射性金屬同位素的鹽在中性條件下與所述DFO-外泌體反應(yīng)，得放射性同位素標(biāo)記的外泌體。

優(yōu)選的，在進(jìn)行所述修飾前，還包括利用PD10柱置換外泌體的溶媒為Na₂CO₃水溶液。

優(yōu)選的，所述修飾包括將所述去鐵氧胺和外泌體進(jìn)行混合后，在恒溫攪拌條件下進(jìn)行孵育。

優(yōu)選的，所述去鐵氧胺和外泌體的質(zhì)量比為1:5～1:10。

優(yōu)選的，所述放射性金屬同位素的鹽包括草酸鋯[⁸⁹Zr]。

優(yōu)選的，所述草酸鋯[⁸⁹Zr]與DFO-外泌體添加比例為32MBq草酸鋯[⁸⁹Zr]：1nmolDFO-exosome，該反應(yīng)體系中還包括0.25M的HEPES，其中草酸鋯[⁸⁹Zr]和DFO-外泌體的混合溶液與HEPES的體積比為3.75：1。

優(yōu)選的，得DFO-外泌體后，以及得放射性同位素標(biāo)記的外泌體后，均包括利用PD10柱純化，利用生理鹽水洗脫，收集洗脫液。