[發明專利]檢測四種呼吸道病毒的等溫多自配引發擴增試劑和試劑盒

在審

• 申請號: 202211304296.7
• 申請日: 2022-10-24
• 公開（公告）號: CN115852048A
• 公開（公告）日: 2023-03-28
• 發明（設計）人: 馬學軍;申辛欣;李逢鈺;許文波
• 申請（專利權）人: 中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 北京高沃律師事務所 11569
• 代理人: 蘇士瑩

本發明屬于分子檢測技術領域，具體涉及檢測四種呼吸道病毒的等溫多自配引發擴增試劑和試劑盒。本發明提供了一種檢測呼吸道病毒的等溫多自配引發擴增試劑，針對每種病毒分別設計6條引物，分別是四條混合式引物(DsF、DsR、FIT和RIT)和兩條非混合式引物(SteR和SteF)。本發明基于新型等溫多自配引發擴增技術(IMSA)建立了對新型冠狀病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒的快速檢測方法，整個檢測時間可縮短至1.5小時內，檢測靈敏度和特異性可與實時熒光定量PCR媲美，并可完成可視化檢測，且無需特殊儀器。

技術領域

本發明屬于分子檢測技術領域，具體涉及檢測四種呼吸道病毒的等溫多自配引發擴增試劑和試劑盒。

背景技術

近年來，核酸擴增技術成為病原微生物快速檢測的主要手段。目前，核酸擴增主要基于兩種策略：一種是通過升溫降溫來完成模板變性、退火、延伸：另一種是在等溫條件下由特殊功能性酶的作用下，完成模板的大量擴增。傳統的聚合酶鏈式反應(PCR)是基于熱循環的核酸分子擴增技術。隨著PCR技術的發展，實時熒光定量PCR、多重PCR、巢式PCR及逆轉錄PCR也相繼被開發出來。PCR技術目前已經廣泛采用被作為分子診斷的標準分析技術，但在現場檢測合床旁檢測(POCT)的應用中受限。而等溫擴增技術僅需要簡單的恒溫裝置即可實現，且與PCR相比，能在短時間內產生大量擴增子，實現快速檢測，但是擴增效率較低。

現有技術開發的新型的等溫核酸擴增技術，即等溫多自配引發擴增(isothermalmultiple self-matching-initiated amplication，IMSA)，在等溫核酸擴增過程中會產生多倍數的能自我配對繼而引發循環擴增的特殊核苷酸結構(self-matching structure，SMS)。這種結構的大量產生富集，使得隨后循環擴增引發幾率明顯增加，繼而使得擴增效率增加，最終使得檢測靈敏度提升。但是目前并沒有基于IMSA檢測呼吸道病毒的研究。

發明內容

本發明的目的在于提供檢測四種呼吸道病毒的等溫多自配引發擴增試劑和試劑盒，可用于可視化檢測四種常見的呼吸道病毒，靈敏度高、特異性良好。

本發明提供了一種檢測呼吸道病毒的等溫多自配引發擴增試劑，所述等溫多自配引發擴增試劑包括針對呼吸道病毒的特異基因設計的引物，針對每種呼吸道病毒分別設計6條引物；

當所述呼吸道病毒為新型冠狀病毒時，所述特異基因包括ORFlab基因和/或N基因；

當所述呼吸道病毒為甲型流感病毒時，所述特異基因為Matrix基因；

當所述呼吸道病毒為乙型流感病毒時，所述特異基因為NS1基因；

當所述呼吸道病毒為呼吸道合胞病毒時，所述特異基因為Polymerase基因。

優選的，當所述呼吸道病毒為新型冠狀病毒時，所述6條引物包括ORF1ab-DsF、ORF1ab-DsR、ORF1ab-FIT、ORF1ab-RIT、ORF1ab-SteF和ORF1ab-SteR，或N-DsF、N-DsR、N-FIT、N-RIT、N-SteF和N-SteR；

其中ORF1ab-DsF的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，ORF1ab-DsR的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，ORF1ab-FIT的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，ORF1ab-RIT的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，ORF1ab-SteF的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，ORF1ab-SteR的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

N-DsF的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，N-DsR的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，N-FIT的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，N-RIT的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，N-SteF的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，N-SteR的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。