[發明專利]一種金黃色葡萄球菌SdrC蛋白基因敲除的方法

在審

• 申請號: 202211284168.0
• 申請日: 2022-10-20
• 公開（公告）號: CN116218751A
• 公開（公告）日: 2023-06-06
• 發明（設計）人: 齊保闖;李川;徐永清;姜偉;浦路橋
• 申請（專利權）人: 昆明醫科大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/31;C12N15/74;C12R1/445
• 代理公司: 合肥興東知識產權代理有限公司 34148
• 代理人: 齊小松

本發明屬于基因工程技術領域，具體來說，涉及一種金黃色葡萄球菌SdrC蛋白基因敲除的方法，包括根據金黃色葡萄球菌的基因組序列，設計出SdrC蛋白上下游同源臂序列的引物，交疊PCR擴增金黃色葡萄球菌RN4220融合片段，sdrC重組自殺質粒構建，載體轉化，缺失突變株構建，通過測序驗證最終敲除菌株等步驟。本發明提供的金黃色葡萄球菌SdrC蛋白基因敲除的方法，通過構建SdrC重組自殺質粒，構建敲除載體，將載體電轉化RN4220野生株，構建缺失突變株，最后成功敲除功能注釋一樣的SdrC氨基酸片段，抑制SdrC蛋白介導的生物膜形成，減緩金黃色葡萄球菌對宿主的感染。

技術領域

本發明涉及基因工程技術領域，具體涉及一種金黃色葡萄球菌SdrC蛋白基因敲除的方法。

背景技術

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus?aureus),是廣泛存在于人群中的一種革蘭氏陽性(G+)條件致病菌,可以引起骨髓炎等一系列疾病。而金黃色葡萄球菌SdrC蛋白的主要功能在于可以通過蛋白自身的二聚化作用促進金葡菌生物膜形成，幫助細菌在宿主表面的增殖。目前還沒有非常有效的方法來控制骨髓炎金黃色葡萄球菌的感染。

基因敲除(gene?knockout)，又稱基因打靶，是一種新型的分子生物學技術，它利用DNA轉化技術，將構建的打靶載體導入靶細胞后，通過重組載體DNA序列和靶細胞內染色體上同源DNA序列，將載體DNA定點整合入靶細胞基因組上某一確定的位點，或與靶細胞基因組上某一確定片段置換，使機體特定的基因失活或缺失，從而改變細胞遺傳特性的方法。然而，目前的細菌基因敲除方法較多，再加上細菌的種類繁多，其形態特征、內部結構和生理特性具有較大的差異，所以細菌基因敲除技術的難度較大；且通過基因工程技術抑制SdrC蛋白介導的生物膜形成，減緩金黃色葡萄球菌對宿主感染的基因敲除方法未見報道。

鑒于以上情況，有必要研究一種金黃色葡萄球菌SdrC蛋白基因敲除的方法。

發明內容

為了解決上述技術問題，本發明提供了一種金黃色葡萄球菌SdrC蛋白基因敲除的方法，以解決現有技術中存在的上述問題。

為了實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

第一方面，本發明提供一種金黃色葡萄球菌SdrC蛋白基因敲除的方法，包括以下步驟：

(1)根據金黃色葡萄球菌的基因組序列，設計出SdrC蛋白上游同源臂序列的上游引物RN4220-sdrc-up-F和下游引物RN4220-sdrc-up-R，設計出SdrC蛋白下游同源臂序列的上游引物RN4220-sdrc-down-R和下游引物RN4220-sdrc-down-F；

(2)采用交疊PCR擴增方法，以金黃色葡萄球菌的基因組DNA為模板，以所述上游引物RN4220-sdrc-up-F和下游引物RN4220-sdrc-up-R進行擴增，獲得SdrC蛋白上游同源臂片段；以所述上游引物RN4220-sdrc-down-R和下游引物RN4220-sdrc-down-F進行擴增，獲得蛋白SdrC下游同源臂片段；

(3)以上游同源臂片段和下游同源臂片段為模板，進行交疊PCR擴增，融合上游同源臂片段和下游同源臂片段，獲得SdrC蛋白的上下游同源臂的融合片段；

(4)利用上游引物sdrC-pkoR1-F和下游引物sdrC-pkoR1-R進行SdrC同源臂片段擴增構建敲除載體，制備pKOR1制粒載體框架后進行無縫克隆，構建出SdrC重組自殺質粒；

(5)將構建的SdrC重組自殺質粒電轉化至金黃色葡萄球菌野生株，經篩選后通過構建缺失突變株獲得SdrC蛋白基因敲除的金黃色葡萄球菌。

優選地，步驟(1)中，所述上游同源臂序列的上游引物RN4220-sdrc-up-F和下游引物RN4220-sdrc-up-R的堿基序列分別為：