[發明專利]一種三重DARQ-LAMP等溫擴增技術同時檢測對蝦病原體的方法

在審

• 申請號: 202211281262.0
• 申請日: 2022-10-19
• 公開（公告）號: CN115595380A
• 公開（公告）日: 2023-01-13
• 發明（設計）人: 張明洲;付賢樹;王倩;馬骉;孫凱
• 申請（專利權）人: 中國計量大學
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/70;C12Q1/6844;C12R1/645
• 代理公司: 杭州橙知果專利代理事務所(特殊普通合伙) 33261
• 代理人: 范琪美

1.一種三重DARQ-LAMP等溫擴增技術同時檢測對蝦病原體的方法，其特征在于：包括以下步驟：

S1、用消毒過的鑷子從被感染對蝦中取出肝胰臟組織；然后在研磨器中研磨均勻，操作置于冰上進行，待組織磨成勻漿后，即可放入冰箱中保存；

S2、使用商業試劑盒從50mg受感染的蝦肝胰腺中提取總DNA；通過在紫外分光光度計上測量A260/A280的比例來確定提取的DNA的數量和質量；

S3、qPCR引物探針設計：與LAMP靶標基因相同，使用Primer premier軟件設計引物和Taqman探針，探針標記FAM熒光基團；進行制備；

S4、優化三重DARQ-LAMP，使用三種熒光標記的探針和不同的探針濃度；

S5、通過S2中制備的10倍濃度梯度的對蝦白斑綜合征病毒、傳染性皮下和造血細胞壞死病毒、蝦肝腸孢蟲的基因組DNA進行靈敏度實驗。每個濃度梯度取2.5μL當做模板加入到反應當中進行三重DARQ-LAMP反應；

S6、通過使用基因組DNA試劑盒來提取實驗病毒與菌株的基因組DNA；使用提取的DNA用于上述優化好的三重DARQ-LAMP方法進行特異性實驗；通過特異性分析評估DARQ-LAMP方法學的準確性；

其中，S3中DARQ-LAMP探針合成制備過程如下：

a、首先WSSV-FIP(BHQ1)與WSSV-FD(FAM)干粉放入離心機中，離心。

b、用TE緩沖液將FIP和FD溶解，用微量移液槍混勻；

c、將用微量移液槍混勻后的混合物放入金屬恒溫水浴鍋中98℃，10分鐘；

d、通過風冷裝置(2)將冷卻腔(11)內的冷卻液從進水管(10)吸入換液腔(12)內；在換液腔(12)內對冷卻液進行冷卻；再由出水管(13)進入冷卻腔(1)內；在冷卻的時候使冷卻液開始流動；所述風冷裝置(2)包括設于換液腔(12)內的第一偏心環(20)、設于所述第一偏心環(20)上的多個移動槽(21)、設于所述移動槽(21)上的移動板(22)、設于所述移動板(22)上的偏心板(23)、設于所述第一偏心環(20)上的風冷腔(24)、設于所述移動槽(21)內壁上的第一單向閥(25)、設于所述冷卻腔(24)內壁上的第二單向閥(26)；驅動第一偏心環(20)開始在換液腔(12)內偏心旋轉；此時偏心板(23)會沿換液腔(12)內壁旋轉移動；將冷卻液從進水管(10)吸入到換液腔(12)內；同時偏心板(23)會抵壓移動板(22)在移動槽(21)內移動；此時將外界的空氣吸入風冷腔(24)內，對換液腔(12)內的冷卻液進行風冷；經過冷卻的冷卻液由出水管(13)再次進入冷卻腔(11)內；冷卻液驅動冷卻環(14)旋轉，然后冷卻環(14)開始驅動冷卻裝置(4)啟動，將主體(1)內的水吸入冷卻盤(15)內，通過冷卻裝置(4)對水進行冷卻，再排出；所述冷卻裝置(4)包括設于所述冷卻腔(11)內壁上的旋轉輥(40)、設于所述旋轉輥(40)上的偏心塊(41)、設于所述偏心塊(41)上的第二偏心環(42)、設于所述冷卻盤(15)側壁上的兩個開口(43)、設于所述第二偏心環(42)上的進水板(44)、設于所述第二偏心環(41)內的水冷腔(45)、設于所述冷卻盤(15)上的聯通管(46)、設于所述第二偏心環(42)內的水冷腔(47)；冷卻環(14)旋轉的時候帶動旋轉輥(40)旋轉，然后偏心塊(41)開始偏心旋轉；帶動第二偏心環(42)在冷卻盤(15)內沿內壁偏心旋轉移動；此時將主體(1)內的水通過其中一個開口(43)吸入冷卻盤(15)內；進一步的第二偏心環(42)的移動會帶動進水板(44)上下移動，將冷卻腔(11)內的冷卻液吸入水冷腔(47)內；此時冷卻液對冷卻盤(15)內的水進行冷卻，然后經過冷卻的水再由另一個開口(43)排到主體(1)內；直到水降溫至室溫，拿出混合物；

e、放置4℃冰箱保存代用。

2.根據權利要求1所述的一種三重DARQ-LAMP等溫擴增技術同時檢測對蝦病原體的方法，其特征在于：所述S4中所使用的熒光標記是FAM，Cy5和VIC，可以在ABI7500Plus^TM儀器中同時進行監測；探針的不同濃度為0.2μM，0.4μM，0.8μM，1.2μM。