[發明專利]一種將hTERT基因定向敲入豬原代肺泡巨噬細胞獲得永生化細胞系的方法及應用

在審

• 申請號: 202211269735.5
• 申請日: 2022-10-18
• 公開（公告）號: CN116200427A
• 公開（公告）日: 2023-06-02
• 發明（設計）人: 王曉虎;羅勝軍;張翩;王剛;蔡汝健;趙夢坡
• 申請（專利權）人: 廣東省農業科學院動物衛生研究所
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/90;C12N15/54;C12N15/55;C12N15/113;C12N5/10
• 代理公司: 深圳市創富知識產權代理有限公司 44367
• 代理人: 梁嘉朗

本發明屬于生物技術與細胞工程技術領域，具體涉及一種將hTERT基因定向敲入豬原代肺泡巨噬細胞獲得永生化細胞系的方法及應用。本發明通過將目的基因hTERT導入到豬基因組的ROSA26安全位點，所得細胞系可以將外源基因整合入基因組內已知的安全位點，實現轉入基因的正常表達而又不影響細胞的正常生理功能，所得細胞系能夠穩定且正確的表達hTERT蛋白，并且在一定程度上具備了永生化的潛能。為構建高效、穩定增殖的永生化PAM細胞系奠定了實驗基礎，也可為非洲豬瘟病毒的分離、增殖特性、致病性及致病機制研究等提供參考。

技術領域

本發明屬于生物技術與細胞工程技術領域，具體涉及一種將hTERT基因定向敲入豬原代肺泡巨噬細胞獲得永生化細胞系的方法及應用。

背景技術

非洲豬瘟(African?swine?fever，ASF)，給生豬產業成了巨大的經濟損失。非洲豬瘟疫情難以控制的主要原因之一，是目前世界范圍內尚無商品化的有效疫苗，其中，沒有適合的傳代細胞系用于非洲豬瘟病毒(African?swine?fever?virus，ASFV)增殖恰恰是非洲豬瘟疫苗研發和生產的一個重要限制因素。

ASFV可在COS-1、COS-7以及CV1細胞系內傳代，但是，這些經傳代增殖的ASFV由于外膜脂質產生變化，導致之前可產生中和反應的血清對以傳代方式降低毒力的毒株不再具備良好的中和活性。而ASFV在原代細胞上的增殖幾乎不存在類似情況，使用原代豬肺泡巨噬細胞增殖的ASFV用于疫苗研發，效果非常優異。然而，原代豬肺泡巨噬細胞每次均需要取仔豬新鮮豬肺臟制備，不適合產業化生產疫苗使用。因此，利用基因工程技術將原代豬肺泡巨噬細胞永生化為可傳代細胞系，對于非洲豬瘟病毒的增殖和疫苗生產具有非常重要的意義。

正常組織來源的細胞通常可以在適當的體外條件下生長和繁殖，但經過數次的傳代后，就會停止增殖并開始衰老和死亡，為了使細胞能夠不斷應用于實驗研究，建立永生化細胞系尤為重要。細胞自發永生化的幾率非常小，通過基因轉染等技術將外源性永生化基因(如病毒、原癌基因和抑癌基因突變體等)導入目的細胞內，以增加永生化的發生率，進而建立永生化細胞系，使其在體外培養時能夠無限傳代，具備穩定的增殖特性，并保持著細胞原有的分化特性，從而為細胞培養技術的進一步應用提供理想的體外細胞模型。

近年來，應用端粒酶的催化亞單位端粒酶逆轉錄酶(telomerase?reversetranscriptase,TERT)延長細胞的生命期是當前研究的熱點。相對于病毒、原癌基因等永生化基因，TERT具有許多優越性。由于端粒酶活性與TERT基因的表達呈正相關，而TERT的經典功能是合成端粒DNA維持端粒穩定性，因此通過TERT轉染建立的永生化細胞可以保持正常細胞的生理特性，具有正常的生長速率，正常的核型，呈現生長錨著依賴性和接觸生長抑制性，是一種非常理想的細胞來源。可以為非洲豬瘟病毒的分離、增殖特性、致病性及致病機制研究等提供參考，對于非洲豬瘟病毒疫苗的研制、生產具有非常重要的意義。然而，目前尚未有利用TERT基因建立豬原代肺泡巨噬細胞永生化細胞系的報道。

綜上可見，為了克服目前尚未具備非洲豬瘟有效疫苗的問題，亟需一種豬原代肺泡巨噬細胞永生化細胞系，以為ASFV增殖、疫苗生產和致病機理研究提供平臺。

發明內容

為了克服上述現有技術的不足，本發明提出了一種利用CRISPR-Cas9技術將hTERT基因定向敲入豬原代肺泡巨噬細胞獲得永生化細胞系的方法，通過將目的基因hTERT導入到豬基因組的ROSA26安全位點，所得細胞系可以將外源基因整合入基因組內已知的安全位點，實現轉入基因的正常表達而又不影響細胞的正常生理功能，該細胞系能夠穩定且正確的表達hTERT蛋白，并且具備了永生化的潛能。

為了實現上述目的，本發明所采用的技術方案是：

本發明提供了一種利用CRISPR-Cas9技術將hTERT基因定向敲入豬原代肺泡巨噬細胞獲得永生化細胞系的方法，所述方法包括以下步驟：