[發明專利]一種解淀粉芽孢桿菌底盤菌及其構建方法與應用

在審

• 申請號: 202211257312.1
• 申請日: 2022-10-14
• 公開（公告）號: CN116218750A
• 公開（公告）日: 2023-06-06
• 發明（設計）人: 李玉;路福平;劉逸寒;李慶剛;宋廣超;史超碩
• 申請（專利權）人: 天津科技大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N9/48;C12N9/64;C12N15/75;C12N15/57;C12R1/07
• 代理公司: 北京瑞盛銘杰知識產權代理事務所(普通合伙) 11617
• 代理人: 栗華楠

本發明屬于生物工程技術領域，涉及工業微生物的育種，特別涉及一種底盤敲除菌株及其應用。所述解淀粉芽孢桿菌基因工程菌株，不表達解淀粉芽孢桿菌基因組上的六種胞外蛋白酶基因aprE，bpr，vpr，mpr，nprE，epr，胞外多糖基因簇eps，聚谷氨酸基因簇pgs和sacB基因構建底盤菌，并在此基礎上異源表達角蛋白酶基因kerk、氨肽酶基因ywaD、堿性蛋白酶基因AprE，最終獲得了一種解淀粉芽孢桿菌底盤菌株及能夠高產角蛋白酶、氨肽酶以及堿性蛋白酶的生產菌株，為構建蛋白酶高產菌株提供了新的思路。

技術領域：

本發明屬于生物工程技術領域，涉及工業微生物的育種，特別涉及一種底盤菌株及其構建方法與用途。

背景技術：

角蛋白酶(keratinase，E.C.3.4.21/24/99.11)是一類能夠將不溶性角蛋白特異性降解為可溶性蛋白質、多肽或者氨基酸的蛋白酶類。細菌角蛋白酶在實際應用中受到廣泛關注。微生物發酵法處理羽毛是目前發展較快的方法，該法利用微生物發酵過程的產酶體系對羽毛進行降解，反應條件溫和，可以最大限度的保留營養元素；降解產物包含羽毛所含的氨基酸組分，且對動物體的必需氨基酸含量顯著提高；微生物發酵法處理羽毛過程能耗少，對環境友好。其在制革中具有廣泛的應用前景。

氨肽酶(Aminopeptidases，簡稱APs，EC?3.4.11)是一類外切蛋白酶，它能夠選擇性地降解多肽鏈和蛋白質N末端氨基酸殘基，釋放出游離氨基酸。其通過催化降解苦味肽N末端的疏水性氨基酸殘基，可達到降低苦味的目的。因此，利用氨肽酶可以顯著改善酪蛋白和大豆蛋白水解液的水解程度，降低苦味。氨肽酶酶法脫苦的水解效率高，條件溫和，易于操作，因此被廣泛應用于食品等現代工業中。但是現有的氨肽酶普遍存在產量低、酶活力較差且在高溫條件下容易失活等問題。在食品加工等領域缺乏高催化活性和穩定性的氨肽酶。

堿性蛋白酶，一類能夠催化水解肽鍵的酶，其活性中心含絲氨酸，又稱絲氨酸蛋白酶，在pH值偏堿性范圍內水解蛋白質肽鍵的酶類，它不但能水解肽鍵，還具有水解酰胺鍵、酯鍵以及轉酯和轉肽的功能。其在食品、洗滌及制革等行業中有著廣泛的用途。由于微生物蛋白酶均為胞外酶，與動、植物源蛋白酶相比具有下游技術處理相對簡單、價格低廉、來源廣、菌體易于培養、產量高、高產菌株選育簡單、快速、具有動植物蛋白酶所具有的全部特性，且相對中性蛋白酶具有更強的水解能力和耐堿能力，有較大耐熱性且有一定的酯酶活力，易于實現工業化生產。

因此，現有技術中需要深入挖掘具有工業應用屬性的角蛋白酶、氨肽酶以及堿性蛋白酶，更多途徑地獲取角蛋白酶、氨肽酶以及堿性蛋白酶，更方便地利用角蛋白酶、氨肽酶以及堿性蛋白酶進行工業生產。

發明內容：

針對上述問題，本發明的目的是通過對宿主的基因工程改造，提供能夠高產角蛋白酶、氨肽酶以及堿性蛋白酶的解淀粉酶芽孢桿菌底盤菌株。

為了實現上述目的，本發明采取如下的技術方案：

第一方面，本發明提供一種解淀粉芽孢桿菌基因工程菌株，該基因工程菌株不表達解淀粉芽孢桿菌宿主基因組上的六種胞外蛋白酶基因aprE，bpr，vpr，mpr，nprE，epr，胞外多糖基因簇eps，聚谷氨酸基因簇pgs，和sacB基因；

進一步地，所述解淀粉芽孢桿菌宿主為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)CGMCC?No.11218；

所述sacB基因，具有SEQ?ID?NO：1所示的核苷酸序列；

所述胞外蛋白酶基因aprE，具有SEQ?ID?NO：2所示的核苷酸序列；

所述胞外蛋白酶基因bpr，具有SEQ?ID?NO：3所示的核苷酸序列；

所述胞外蛋白酶基因vpr，具有SEQ?ID?NO：4所示的核苷酸序列；

所述胞外蛋白酶基因mpr，具有SEQ?ID?NO：5所示的核苷酸序列；