[發(fā)明專(zhuān)利]一種源于禽環(huán)形病毒2型VP1蛋白的細(xì)胞穿膜肽及其設(shè)計(jì)和應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202211249315.0
• 申請(qǐng)日: 2022-10-12
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN115947799A
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-04-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 呼高偉;尹龍飛;付永前;郭慶;平青波
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 臺(tái)州學(xué)院
• 主分類(lèi)號(hào): C07K14/08
• 分類(lèi)號(hào): C07K14/08;C07K19/00;A61K39/385;A61K47/64
• 代理公司: 杭州合信專(zhuān)利代理事務(wù)所(普通合伙) 33337
• 代理人: 黃平英

本發(fā)明發(fā)明公開(kāi)了一種源于禽環(huán)形病毒2型VP1蛋白的細(xì)胞穿膜肽及其設(shè)計(jì)和應(yīng)用，從禽環(huán)形病毒2型(Avian?Gyrovirus?2，AGV2)VP1蛋白中發(fā)現(xiàn)并鑒定一種新型細(xì)胞穿膜肽(AGV2?VP1?CPP?aa?24?44)，其氨基酸序列如SEQ?IDNO：1所示，該穿膜肽可攜帶FITC自發(fā)進(jìn)入293T、Hela和3D4/21等多種細(xì)胞，而且在相同濃度的條件下其比之前的穿膜肽Du?Cap?aa18?37高2倍。該穿膜肽可作為高效介導(dǎo)核酸類(lèi)疫苗與藥物進(jìn)入細(xì)胞的傳導(dǎo)載體，進(jìn)一步提高細(xì)胞對(duì)核酸疫苗的攝取效率與免疫刺激作用，在基因治療和核酸疫苗領(lǐng)域發(fā)揮重要的作用。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種源于禽環(huán)形病毒2型VP1蛋白高效細(xì)胞穿膜肽的設(shè)計(jì)與作為核酸疫苗傳遞載體的應(yīng)用

背景技術(shù)

疫苗是防控傳染性疾病以及治療腫瘤的有力“武器”之一。近年來(lái)，在傳統(tǒng)的滅活疫苗和減毒活疫苗研制的技術(shù)基礎(chǔ)上，采用基因工程、合成生物學(xué)、分子生物學(xué)等現(xiàn)代生物技術(shù)，開(kāi)發(fā)出了新型核酸疫苗。核酸疫苗也稱(chēng)基因疫苗，將編碼抗原蛋白的外源基因(DNA或mRNA)導(dǎo)入(通過(guò)肌肉注射、電轉(zhuǎn)和病毒介導(dǎo)等方式)動(dòng)物體細(xì)胞內(nèi)，從而在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)和合成抗原蛋白，誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生對(duì)該抗原蛋白的免疫反應(yīng)，進(jìn)而達(dá)到預(yù)防和治療疾病的目的。

根據(jù)核酸疫苗所含成分的不同主要分為DNA疫苗和mRNA疫苗。核酸疫苗與傳統(tǒng)的滅活疫苗和亞單位疫苗相比，有諸多優(yōu)勢(shì)，例如：(1)抗原設(shè)計(jì)靈活，可以合成表達(dá)幾乎所有的蛋白質(zhì)抗原，為抗原設(shè)計(jì)提供了極大的靈活性；(2)免疫刺激性強(qiáng)，可同時(shí)刺激機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)；(3)制備簡(jiǎn)單，只需對(duì)編碼抗原的基因進(jìn)行設(shè)計(jì)和克隆，提取質(zhì)粒；(4)同時(shí)具備預(yù)防性和治療性作用；(5)另外就mRNA疫苗而言無(wú)需要整合到宿主的基因組，生物安全性好，而且研發(fā)周期短適合應(yīng)對(duì)突發(fā)性傳染病。

mRNA疫苗是近年興起的一種新型核酸疫苗。其原理是將編碼抗原蛋白的mRNA導(dǎo)入細(xì)胞質(zhì)，利用細(xì)胞內(nèi)蛋白合成系統(tǒng)生成抗原，進(jìn)而激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)來(lái)應(yīng)對(duì)病原體感染。mRNA疫苗的抗原表達(dá)效率高，因無(wú)需進(jìn)入細(xì)胞核即可完成翻譯，其表達(dá)抗原蛋白效率較高。

目前已有多種以mRNA技術(shù)為基礎(chǔ)的候選疫苗被研制出來(lái)，表明mRNA疫苗具有廣闊的應(yīng)用前景。然而，由于mRNA分子量較大，且與細(xì)胞膜一樣都帶有負(fù)電荷，所以導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)mRNA的攝取率低，同時(shí)，核酸疫苗容易被細(xì)胞外核酸酶降解等問(wèn)題極大地降低了其生物利用度。因此，如何以合適的給藥途徑以及最佳的傳導(dǎo)載體系統(tǒng)將核酸疫苗(DNA或mRNA)高效地投遞到細(xì)胞中，而且不影響抗原蛋白的表達(dá)是核酸疫苗研發(fā)過(guò)程需重點(diǎn)解決的技術(shù)難題。

近年來(lái)，有關(guān)核酸疫苗傳遞系統(tǒng)的研究主要集中在病毒載體和非病毒傳遞載體。病毒傳遞載體目前比較成熟的是慢病毒和腺病毒載體，兩者雖然遞送效率高，但是遞送載體具有與宿主基因組整合的缺陷，而且存在引發(fā)生物安全性問(wèn)題的隱患。非病毒傳遞載體主要包括基因槍使用、陽(yáng)離子聚合物材料聚乙烯亞胺(PEI)、魚(yú)精蛋白以及研究最多應(yīng)用最廣泛的陽(yáng)離子脂質(zhì)體。帶正電荷的陽(yáng)離子聚合物可實(shí)現(xiàn)與核酸靜電結(jié)合形成絡(luò)合物，遞送核酸進(jìn)入機(jī)體細(xì)胞內(nèi)。但是，上述遞送技術(shù)和復(fù)合物由于熱力學(xué)不穩(wěn)定性和一定的細(xì)胞毒性限制了其被應(yīng)用于遞送核酸疫苗的步伐。魚(yú)精蛋白與mRNA形成的絡(luò)合物，可使mRNA免受核糖核酸酶的降解，并增強(qiáng)機(jī)體免疫反應(yīng)。但是，該絡(luò)合物具有同時(shí)激活Toll樣受體(Toll-like?receptors，TLRs)TLR7和TLR863配體的通路，導(dǎo)致mRNA的免疫原性升高，具有非特異性刺激免疫反應(yīng)的潛在可能性。

而當(dāng)前脂質(zhì)納米顆粒是目前mRNA疫苗和藥物的主流遞送載體，但是仍存在專(zhuān)利壁壘保護(hù)，國(guó)內(nèi)擁有該技術(shù)的企業(yè)極少。而且遞送效率不高。因此，如何將核酸疫苗高效遞送至細(xì)胞內(nèi)并避免被降解是核酸疫苗研發(fā)面臨的另一項(xiàng)關(guān)鍵技術(shù)瓶頸。

發(fā)明內(nèi)容

苯發(fā)明設(shè)計(jì)出一種源于禽環(huán)形病毒2型VP1蛋白的細(xì)胞穿膜肽，能夠?qū)⒑怂嵋呙绺咝нf送至細(xì)胞內(nèi)的同時(shí)避免被降解。