[發明專利]一種敲降HS3ST5基因的sgRNA及其敲降載體和應用

在審

• 申請號: 202211248564.8
• 申請日: 2022-10-12
• 公開（公告）號: CN116179546A
• 公開（公告）日: 2023-05-30
• 發明（設計）人: 袁紅;白興文;盧曾軍;黃磊;宮曉華;劉在新;孫普;李平花;包慧芳;李冬;馬雪青;陳應理;曹軼梅;付元芳;趙志荀;張婧;王健
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院蘭州獸醫研究所
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/867;C12N7/01;C12N5/10;A61K31/7105;A61P31/12
• 代理公司: 北京高沃律師事務所 11569
• 代理人: 薛紅凡

本發明提供了一種敲降HS3ST5基因的sgRNA及其敲降載體和應用，本發明屬于基因敲除技術領域。本發明利用靶向HS3ST5基因的sgRNA構建敲降HS3ST5的重組載體，經過慢病毒包裝后，感染BHK?21細胞系，得到敲降HS3ST5的BHK?21重組細胞系。實驗表明敲降HS3ST5后的BHK?21重組細胞系對FMDV復制能力和增殖能力均顯著降低。因此，穩定敲降HS3ST5的sgRNA可作為一種有效工具應用于利用HS作為受體的病毒感染治療中，為抗病毒感染提供了新思路。

技術領域

本發明屬于基因敲除技術領域，具體涉及一種敲降HS3ST5基因的sgRNA及其敲降載體和應用。

背景技術

隨著CRISPR、TALENs和ZFNs等基因編輯工具的出現以及飛速發展，人為操縱細胞基因組而開發經濟高效重組細胞系成為可能。這些基因編輯工具是序列特異性內切酶，有助于操縱目標基因組上的特定位點DNA的激活或沉默。根據科學研究和工業生產上的實際需求，基因編輯工具允許對靶基因上的單個或多個位點進行整合或刪除，從而使研究人員能夠直接編輯或調節任何類型細胞的DNA功能，最終在系統水平上鑒定和揭示基因組的功能。基因編輯技術推進了新一代治療藥物的開發和基因治療的出現，也成為抗病毒治療的一種潛在方法。

CRISPR發現于細菌和古菌等原核生物的基因組，該序列來自噬菌體的DNA片段，用于檢測和破壞類似噬菌體的DNA。CRISPR相關蛋白(Cas9)是一種蛋白酶，它使用CRISPR序列作為向導來識別和切割與CRISPR序列互補的特定DNA。Cas9有兩個切割結構域，稱為RuvC和HNH，Cas9的兩個核酸酶結構域介導靶DNA的斷裂，并在斷裂處留下鈍端。CRISPR/Cas9系統包含Cas9酶以及crRNA和轉錄激活crRNA(tracrRNA)。crRNA和tracrRNA結合成一種稱為gRNA或sgRNA的嵌合RNA結構，能夠有效的將Cas9激活和引導至sgRNA靶向的20個核苷酸序列的下游一個特定的基序，即原間隔區鄰接基序(PAM)，從而切割入侵DNA中的靶標DNA序列。CRISPR/Cas9系統的靶向特異性由sgRNA?5'末端的20個核苷酸序列決定。對于化膿性鏈球菌CRISPR/Cas9系統，所需的靶序列必須緊接在5'-NGG?PAM基序之前。CRISPR/Cas9基因編輯技術具有脫靶效應低、敲降效率高的優勢，該技術通過sgRNA特異性識別病毒基因組或宿主靶基因位點，精準切割互補雙鏈DNA，發揮抗病毒作用。sgRNA已經在抑制新型冠狀病毒、人類免疫缺陷性病毒和流感病毒等多種病毒中得到應用，表明sgRNA可作為一種廣譜抗病毒工具應用于抗病毒感染中。

硫酸乙酰肝素(HS)是一類線性硫酸化的異構多糖，能夠結合大量的配體，包括生長因子、形態因子、細胞因子、趨化因子、酶、基質蛋白和病毒粒子等，從而在細胞多種生物學過程中發揮調控活性，如受體激活、信號轉導、細胞骨架組裝和細胞外基質重塑等。同時HS能夠通過弱相互作用識別結合呈現正電荷特性的病毒粒子，提高細胞表面上吸附病毒的數量，增強病毒粒子對宿主細胞的感染能力。硫酸乙酰肝素3-O-硫酸基轉移酶5(HS3ST5)是一種HS生物合成酶，能夠催化硫酸基團從硫酸基供體轉移到氨基葡萄糖的3-OH位置而形成3-O-硫酸化的HS，從而調控HS生物學功能發揮。目前HS3ST5對病毒感染影響的研究還很少，也沒有將HS3ST5作為靶點設計新型抗病毒藥物的報道。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的在于提供一種敲降HS3ST5基因的sgRNA，具有較強敲降HS3ST5基因的功能，為拮抗利用HS為受體的病毒感染提供了新思路。

本發明提供了一種敲降HS3ST5基因的sgRNA，所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ?IDNO:1所示。

本發明提供了一種敲降HS3ST5基因的重組載體，所述重組載體為包含所述sgRNA的LentiCRISPRV2載體。

本發明提供了一種敲降HS3ST5基因的重組慢病毒，是由所述重組載體和輔助質粒共轉染細胞拯救得到。