[發明專利]一種體外誘導IPS細胞分化生成人神經元的方法

在審

• 申請號: 202211245632.5
• 申請日: 2022-10-12
• 公開（公告）號: CN115612668A
• 公開（公告）日: 2023-01-17
• 發明（設計）人: 王新娟
• 申請（專利權）人: 王新娟
• 主分類號: C12N5/0793
• 分類號: C12N5/0793;C12N5/0797;C12N5/10
• 代理公司: 東臺金誠石專利代理事務所(特殊普通合伙) 32482
• 代理人: 侯秀君

1.一種體外誘導IPS細胞分化生成人神經元的方法，其特征在于，具體包括下列步驟：

步驟一、將融合度為70-80％的人誘導多能干細胞，加入MEM/F12細胞培養液培養中，在30～38℃、4.5～5.5％的CO₂的培養箱中培養1天；

步驟二、吸棄mTeSR1細胞培養液的上清液以除去未貼壁的細胞，加入神經誘導分化培養液，繼續在30～38℃、4.5～5.5％的CO₂培養箱中培養4～5天得到P1代的神經干細胞，培養過程中隔天換液；

步驟三、將聚鳥氨酸、雷帕霉素添加至培養皿內，之后加入MEM/F12培養基，在32～38℃、4.5～5.5％的CO₂的培養箱中培養1h，將P1代的神經干細胞接種到培養皿中培養6～7天，得到P2代的神經干細胞，培養過程中每間隔2天更換一次培養基；

步驟四、將P2代的神經干細胞轉移至細胞分化培養液內培養10～12天，并加入分散酶將細胞消化并懸浮培養于細胞分化培養液內，得到P3代的神經干細胞；

步驟五、采用Accutase細胞消化液將P3代的神經干細胞消化3～8分鐘后貼壁，神經元貼壁培養液中培養12～15天可以得到成熟的神經元。

2.根據權利要求1所述的一種體外誘導IPS細胞分化生成人神經元的方法，其特征在于，步驟一的MEM/F12細胞培養液中添加有ROCK抑制劑。

3.根據權利要求1所述的一種體外誘導IPS細胞分化生成人神經元的方法，其特征在于，所述神經誘導分化培養液包括MEM/F12培養基、0.5×N2細胞添加劑、0.5×B27細胞添加劑和1×GlutaMax細胞添加劑。

4.根據權利要求1所述的一種體外誘導IPS細胞分化生成人神經元的方法，其特征在于，步驟三中P1代的神經干細胞的接種密度為3.0×10⁴～4.2×10⁴個細胞/cm²。

5.根據權利要求1所述的一種體外誘導IPS細胞分化生成人神經元的方法，其特征在于，所述細胞分化培養液包括DMEM/F12培養基、0.5×N2細胞添加劑、0.5×B27細胞添加劑和1×GlutaMax細胞添加劑。

6.根據權利要求1所述的一種體外誘導IPS細胞分化生成人神經元的方法，其特征在于，所述神經元貼壁培養液包括MEM/F12培養基、1×N2細胞添加劑、1×B27細胞添加劑、腦源性神經營養因子10ng/ml、神經膠質細胞源性神經營養因子10ng/ml、促紅細胞生成素1μM和L-抗壞血酸200μM。