[發明專利]SFTSV膜蛋白桿狀病毒表達系統載體構建方法

在審

• 申請號: 202211244293.9
• 申請日: 2022-10-12
• 公開（公告）號: CN115627274A
• 公開（公告）日: 2023-01-20
• 發明（設計）人: 劉苗苗
• 申請（專利權）人: 濟寧醫學院
• 主分類號: C12N15/866
• 分類號: C12N15/866;C12N15/40;C12N15/62
• 代理公司: 安徽濰達知識產權代理事務所(普通合伙) 34166
• 代理人: 張蘭

本發明公開了SFTSV膜蛋白桿狀病毒表達系統載體構建方法，具體包括以下步驟：步驟一、資料研究；步驟二、優化截取；步驟三、載體構建；步驟四、表達純化，本發明涉及分子病毒學技術領域。該SFTSV膜蛋白桿狀病毒表達系統載體構建方法，通過將含有抗原決定簇的膜蛋白優化后亞克隆到昆蟲桿狀病毒表達載體pFastBacDUAL中，利用昆蟲桿狀病毒表達載體pFastBacDUAL的雙表達載體特性，實現Gn蛋白和Gc蛋白的同時表達，構建同時表達Gn蛋白和Gc蛋白的pFastBacDUAL?Gn/Gc，獲得針對病毒膜蛋白的重組基因工程疫苗，為病毒防控提供思路，并且通過設計不同標簽的方式，方便后期對兩個蛋白分別進行純化，為后續評估兩個蛋白的功能提供了便利。

技術領域

本發明涉及分子病毒學技術領域，具體為SFTSV膜蛋白桿狀病毒表達系統載體構建方法。

背景技術

發熱伴血小板減少綜合征病毒(SFTSV)是2009年以來在我國中東部農村地區引起發熱伴血小板減少綜合征(SFTS)的新發病毒性病原體，SFTS病死率高達10～15％，以SFTSV為代表的新發病毒正在世界蔓延，成為威脅人類健康的重要病毒病原。然而，目前對其致病機理的了解有限，尚無有效的疫苗或特效藥物可供使用，研制安全有效的預防用疫苗是目前SFTSV迫切需要解決的問題，既往研究證實SFTSV的膜蛋白(Gn/Gc)上含有決定病毒與宿主細胞間相互作用的抗原決定簇，目前針對SFTSV重組糖蛋白Gn、Gc表達及其免疫效果評價的研究少見。

疫苗的發展經歷了第一代傳統疫苗、第二代重組疫苗及第三代核酸疫苗三個階段，而針對SFTSV的疫苗研制亦在三方面展開：

1)傳統疫苗是指由減毒的或滅活的病原微生物制得的、具有刺激機體產生針對病原微生物的特異抗體或者細胞免疫的生物制品，研究發現采用β-丙內酯滅活、經超濾濃縮和分子篩層析后獲得的純化SFTSV，可誘導新西蘭兔產生中和抗體和特異性病毒IgG抗體，然而傳統疫苗往往不能同時滿足安全性和高免疫原性的要求，例如，滅活疫苗進入人體后不能生長繁殖，對人體的刺激時間較短；減毒活疫苗需在低溫條件下保存及運輸，有效期相對短暫，存在毒力返祖的風險；

2)重組基因工程疫苗是利用DNA重組生物技術，把天然的或人工合成的遺傳物質定向插入細菌、酵母菌或哺乳動物細胞中，使之充分表達，經純化后而制得的疫苗，針對SFTSV的重組基因工程疫苗研究一直是各個研究單位的工作熱點，Cao等人利用原核表達系統獲得的重組NSs蛋白對C57BL/6J小鼠進行免疫接種，最終發現雖然重組的NSs蛋白可刺激小鼠產生高滴度的 anti-NSs抗體，但未能有效的清除染毒小鼠體內的病毒，研究結果顯示SFTSV 的Gn/Gc蛋白可以與C型凝集素DC-SIGN受體結合進入到動物細胞內，同時 SFTSV的Gn還可以與非肌肉肌球蛋白重鏈IIA結合而進入感染細胞，這表明 SFTSV的糖蛋白與感染識別相關，研究證實人源單克隆抗體能夠中和SFTSV對 Vero細胞的感染，該中和活性的實現可歸因于SFTSV的Gn蛋白與細胞表面受體間的相互作用受到阻斷，這表明Gn蛋白極有可能含有決定病毒與宿主細胞間相互作用的抗原決定簇，抗Gn蛋白特異性抗體是主要的中和抗體，與該研究結果一致，Gao等人亦發現Gn是理想的疫苗靶點，然而目前針對SFTSV重組糖蛋白Gn、Gc表達及其免疫效果評價的研究少見；

3)核酸疫苗是指將含有編碼某種抗原蛋白基因序列的質粒載體或者基因序列作為疫苗，直接導入受試動物細胞內，通過宿主細胞的轉錄系統轉錄并翻譯成抗原蛋白，誘導宿主產生對該抗原蛋白的免疫應答，從而使被接種者獲得相應的免疫保護，南京醫科大學研究團隊發現用SFTSV Gn真核表達質粒免疫BALB/c小鼠，可誘導小鼠產生特異性IgG抗體。

為制備第二代疫苗，即重組疫苗，基于上述資料發現病毒的Gn\Gc上存在抗原決定簇，提示針對上述基因片段制備重組疫苗，有可能獲得中和抗體。為此，特提出SFTSV膜蛋白桿狀病毒表達系統載體構建方法，使用昆蟲桿狀病毒表達載體pFastBacDUAL，將Gn\Gc兩個片段同時構建到該載體上，實現同時表達，大大提高了工作效率。

發明內容