[發明專利]一種特立帕肽的固相合成方法

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• 申請號: 202211244212.5
• 申請日: 2022-10-12
• 公開（公告）號: CN115433266A
• 公開（公告）日: 2022-12-06
• 發明（設計）人: 王豐健
• 申請（專利權）人: 臺州吉諾生物科技有限公司
• 主分類號: C07K14/635
• 分類號: C07K14/635;C07K1/08;C07K1/06;C07K1/04;C07K1/20
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種特立帕肽的固相合成方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1、制備特立帕肽樹脂肽階段，將CTC樹脂加入固相多肽合成儀中，通過DMF洗滌樹脂后，向CTC樹脂后加入Fmoc-Phe-OH和DIPEA，待反應完全后，通過混合液封閉60分鐘后對其進行排干并采用DMF沖洗，然后采用甲醇對其收縮，得到Fmoc-Phe-CTC樹脂，將Fmoc-Phe-CTC樹脂加入合成反應儀中，隨后通過DMF洗滌Fmoc-Phe-CTC樹脂兩次，并在DMF中溶脹30分鐘，然后采用哌啶DMF溶液將Fmoc-Phe-CTC樹脂處理后，繼續采用DMF反復洗滌，待Fmoc基團脫保護后，將Fmoc-Asn(Trt)-OH加入到樹脂肽中，再將HOBt溶于DMF中，并將其加入固相反應合成儀，再向其中加入DIC，室溫下反應3-4小時，通過Kaiser試驗監測偶聯反應的進展，基于特立帕肽的序列，重復上述Fmoc去保護步驟和相應的氨基酸偶聯，最后采用甲醇收縮，排干后得到特立帕肽的樹脂肽；

S2、切割特立帕肽的樹脂肽階段，將裂解試劑加入特立帕肽的樹脂肽中，控制溫度為13-17℃，使其反應3-4小時，反應完成后，過濾樹脂并收集濾液，將濾液加入甲基叔丁基醚中，并攪拌以得到濕固體，將所得固體加入異丙醚中進行打漿洗滌，經過過濾和真空干燥后，得到特立帕肽的線性肽；

S3、純化特立帕肽階段，將特立帕肽的線形肽溶于碳酸氫銨溶液中，并在C18柱上分16次裝載，通過使用流動相梯度洗脫特立帕肽，其中流動相A為TFA水溶液；流動相B為乙腈和甲醇的混合液，同時根據紫外吸光度和UPLC的分析來收集組分，將純度99%和其他雜質0.1%的組分收集起來并合并，然后進行凍干，得到純度為99.6%的純固體，所有雜質含量都低于0.1%。

2.根據權利要求1所述的一種特立帕肽的固相合成方法，其特征在于：步驟S1中，在固相合成中，分別在特立帕肽的序列30和31位上使用Fmoc-Asp(OtBu)-DmbVal-OH，用于防止天冬氨酰亞胺的形成，分別在特立帕肽樹脂肽的序列9、14和32位使用Fmoc-His(MBom)-OPfp，用于控制D-His的外消旋雜質。

3.根據權利要求1所述的一種特立帕肽的固相合成方法，其特征在于：步驟S2中，所述裂解試劑按照如下體積比進行配置，TFA：TIS：水：苯甲硫醚：吲哚：甲氧基胺鹽酸鹽為85：2.5：2.5：5.0：2.5：2.5，用于控制雜質Met(O)18、Met(O)8以及Met(O)18和Met(O)8雜質的混合物的產生。

4.根據權利要求1所述的一種特立帕肽的固相合成方法，其特征在于，步驟S1中，包括以下階段：

步驟S10、固相合成的第一步，將Fmoc-Phe-OH的羧基錨定到固相載體上；

步驟S11、在錨定第一個氨基酸后，使用哌啶DMF溶液裂解Fmoc基團，游離氨基將與序列中的下一個氨基酸即Fmoc-Asn(Trt)-OH在偶聯試劑如DIC的存在下偶聯；

步驟S12、第二個氨基酸偶聯后，連接的Fmoc基團被裂解，同樣，序列中的其他氨基酸按以下順序偶聯和裂解，Fmoc-His(MBom)-OPfp,Fmoc-Asp(OtBu)-DmbVal-OH,Fmoc-Gln(Trt)-OH,Fmoc-Leu-OH,Fmoc-Lys(Boc)-OH,Fmoc-Lys(Boc)-OH,Fmoc-Arg(Pbf)-OH,Fmoc-Leu-OH,Fmoc-Trp(Boc)-OH,Fmoc-Glu(OtBu)-OH,Fmoc-Val-OH,Fmoc-Arg(Pbf)-OH,Fmoc-Glu(OtBu)-OH,Fmoc-Met-OH,Fmoc-Ser(tBu)-OH,Fmoc-Asn(Trt)-OH,Fmoc-Leu-OH,Fmoc-His(MBom)-OPfp,Fmoc-Lys(Boc)-OH,Fmoc-Gly-OH,Fmoc-Leu-OH,Fmoc-Asn(Trt)-OH,Fmoc-His(MBom)-OPfp,Fmoc-Met-OH,Fmoc-Leu-OH,Fmoc-Gln(Trt)-OH,Fmoc-Ile-OH,Fmoc-Glu(OtBu)-OH,Fmoc-Ser(tBu)-OH,Fmoc-Val-OH, Boc-Ser(tBu)-OH。