[發明專利]一種環境樣本DNA采集保存及非洲豬瘟病毒檢測方法

在審

• 申請號: 202211242422.0
• 申請日: 2022-10-11
• 公開（公告）號: CN115404267A
• 公開（公告）日: 2022-11-29
• 發明（設計）人: 張紅云;嚴斯剛;陳秋英;陸志翔;羅廷榮;盧軍;覃春敏;韋青藏;王翠;黃鑫慧;梁競臻
• 申請（專利權）人: 廣西大學;廣西璞締恩葳生物技術有限公司;柳州市動物疫病預防控制中心;柳州市柳江區動物疫病預防控制中心
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12Q1/70;C12Q1/6851;C12R1/93
• 代理公司: 廣西知華敏行專利代理事務所(普通合伙) 45139
• 代理人: 陳引

1.一種環境樣本DNA采集保存方法，其特征在于，包括以及步驟：

(1)準備制作DNA保護劑的材料：準備三羥甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸、氯化鈉、十二烷基硫酸鈉、山梨糖醇、葡甘聚糖以及超純水；

(2)制作DNA保護劑：將步驟(1)中所準備好的三羥甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸、氯化鈉、十二烷基硫酸鈉、山梨糖醇、葡甘聚糖全部依次放入超純水中，并通過攪拌使準備的原料全部溶于超純水中，定容之后獲得DNA保護劑；

(3)使用DNA保護劑：將步驟(2)中制作完成的DNA保護劑適量取出，并與收集到的環境樣本進行混合。

2.根據權利要求1所述的一種環境樣本DNA采集保存方法，其特征在于：所述步驟(1)中所準備的三羥甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸、氯化鈉、十二烷基硫酸鈉、山梨糖醇以及葡甘聚糖的含量分別為三羥甲基氨基甲烷80mm--110mm、乙二胺四乙酸90mm--120mm、氯化鈉8mm-12mm、十二烷基硫酸鈉0.2％--0.6％、山梨糖醇0.5％--1.3％以及葡甘聚糖0.5％--1.3％。

3.根據權利要求1所述的一種環境樣本DNA采集保存方法，其特征在于：所述步驟(2)中在將原料與超純水進行溶合之前，將超純水進行滅菌處理。

4.一種非洲豬瘟病毒檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)準備材料：準備豬圓環病毒2型(PCV2)DNA、豬偽狂犬病毒(PRV)DNA和豬細小病毒(PPV)DNA，2×Taq PCR Mastermix(KT201-12)、普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(DP209-02)、pLB零背景快連接試劑盒(VT205-01)、DH5α感受態細胞(CB101-01)和質粒小提試劑盒(DP103-02)，DNA marker LD DS2000(LM1101)以及Animal Detection U+Probe MasterMix(QV110-01)，LB和LA培養基；

(2)重組質粒標準品的構建與鑒定：用P72、CD2v和MGF的引物通過PCR從陽性DNA模板擴增相應基因片段；

(3)三重熒光定量PCR檢測方法的建立：選取大小差異明顯的P72、CD2v和MGF三個片段，用相應的引物和2×Taq PCR Mastermix配合使用，以步驟(2)中所敘述的三個重組質粒為陽性對照，驗證構建的陽性質粒；

(4)特異性實驗：以豬圓環病毒2型(PCV 2)DNA標準物質、豬偽狂犬病毒(PRV)DNA標準物質和豬細小病毒(PPV)DNA標準物質為模板，安裝步驟(3)的方法進行PCR擴增；

(5)敏感性實驗：將重組質粒質粒標準品10倍梯度(從1012-102copies/μL)稀釋后安裝步驟(3)中的方法以三個重組質粒為陽性對照；

(6)穩定性實驗：以上述不同濃度的質粒標準品混合物為模板，利用本研究建立的方法檢測，每個濃度做3個生物學重復，進行組內重復性分析。將上述試驗重復3次，進行組間重復性分析，計算變異系數，分析該方法的重復性。