[發明專利]一種高效功能性磁小體（BMP-CSA）

在審

• 申請號: 202211234696.5
• 申請日: 2022-10-10
• 公開（公告）號: CN116041455A
• 公開（公告）日: 2023-05-02
• 發明（設計）人: 張金菊;王紅光
• 申請（專利權）人: 國科融智（蘇州）生物醫學科技有限公司
• 主分類號: C07K14/36
• 分類號: C07K14/36;C07K17/14;C07K1/22;C12N15/31;C12N15/70;C12N15/66
• 代理公司: 北京卓愛普專利代理事務所(特殊普通合伙) 11920
• 代理人: 王玉松

1.N端加入半胱氨酸的鏈霉親和素(CSA)，其特征在于，所述N端加入半胱氨酸的鏈霉親和素(CSA)的堿基序列為SEQ?ID?NO:1，其氨基酸序列為SEQ?ID?NO:2。

2.磁小體，其特征在于，包括磁小體(BMP)、以及通過雙功能試劑偶聯在磁小體的表面的N端加入半胱氨酸的鏈霉親和素(CSA)，所述N端加入半胱氨酸的鏈霉親和素(CSA)的堿基序列為SEQ?ID?NO:1，其氨基酸序列為SEQ?ID?NO:2。

3.如權利要求2所述的BMP-CSA磁小體，其特征在于，所述雙功能試劑包括琥珀酰亞胺3-(2-吡啶基二硫基)-丙酸酯(SPDP)。

4.如權利要求2-3任一項所述的磁小體的制法，其特征在于，所述BMP-CSA磁小體的制法包括如下步驟：

琥珀酰亞胺3-(2-吡啶基二硫基)-丙酸酯(SPDP)與磁小體(BMP)的表面發生化學反應生成含有吡啶二硫醇BMP-SPDP復合物；

含有吡啶二硫醇BMP-SPDP復合物與N端加入半胱氨酸的鏈霉親和素(CSA)偶聯得到BMP-CSA磁小體。

5.如權利要求2-4任一項所述的N端加入半胱氨酸的鏈霉親和素(CSA)的制法，其特征在于，包括如下步驟：

提取鏈霉菌基因組為模板并利用堿基序列為SEQ?ID?NO:5和SEQ?ID?NO:6所示的引物進行PCR得到目的基因鏈霉親和素；

SEQ?ID?NO:5的引物為：

PET-28a-SAR：

5’-GGTGCTCGAGTGCGGCCGCAAGCTTCTACTGCTGAACGGCGTC-3’；

SEQ?ID?NO:6的引物為：

PET-28a-C-SAF：

5’-TGGACAGCAAATGGGTCGCGGATCCATGTGCGGTGGCGGAGGGTCTGGTGGCGGAGGGTCCGGTGGCGGAGGGTCAGACCCCTCCAAGGACTCG-3’；

用限制性核酸內切酶BamHⅠ和HindⅢ將pET28(a+)進行雙酶切，將目的基因鏈霉親和素克隆至載體上，得到載體pET28-CSA；

pET28-CSA通過熱激轉化的方法轉化進入表達菌株E.coli?BL21中，涂布卡那霉素抗性平板，選用堿基序列為SEQ?ID?NO:7的T7、堿基序列為SEQ?ID?NO:8的T7?term.rev菌落PCR進行驗證，擴增出500bp左右的目的條件，篩選正確的菌株E.coli?BL2-CSA；

T7的堿基序列為：

5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’；

T7?term.rev的堿基序列為：

5’-TGCTAGTTATTGCTCAGCGG-3’；

將篩選正確的菌株E.coli?BL2-CSA在搖瓶培養基中培養，加入終濃度為1mM的IPTG進行誘導表達，SDS-PAGE觀察蛋白表達情況；

對E.coliBL2-CSA進行搖瓶表達，選用鎳親和層析柱進行純化，得到大腸桿菌外源表達的N端加入半胱氨酸的鏈霉親和素(CSA)。

6.如權利要求5所述的BMP-CSA磁小體的制法，其特征在于，SEQ?ID?NO:3和SEQ?ID?NO:4所示的引物進行PCR中：

PCR反應體系(50μl)如下：

PCR程序如下：