[發明專利]快速測定人血漿中PSTs及TTX類物質的檢測方法

在審

• 申請號: 202211220792.4
• 申請日: 2022-10-08
• 公開（公告）號: CN115598246A
• 公開（公告）日: 2023-01-13
• 發明（設計）人: 陸優麗;梁艷;忻亮;劉罡一;昌薇;王偉;李水軍;楊雙雙;張美微;姜鳳麗;于凡;谷雨婷;余琛
• 申請（專利權）人: 上海市徐匯區中心醫院
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06;G01N30/14;G01N30/72
• 代理公司: 上海申浩律師事務所 31280
• 代理人: 沈其梅

本發明公開了一種快速測定人血漿中PSTs及TTX類物質的檢測方法，所述方法包括以下步驟：(1)取血漿樣品，加入含三氯乙酸的乙腈溶液沉淀劑，進行蛋白沉淀后，取得過濾液；(2)將親水作用固相萃取板按照活化、平衡、將過濾液上樣、淋洗、洗脫的步驟獲得洗脫下來的洗脫液；(3)對步驟(2)洗脫下來的洗脫液進行LC?MS/MS分析，測定PSTs及TTX類物質的含量。本發明方法可以用于定性、定量檢測人血漿中PSTs及TTX類物質，結果可靠、檢測限低，速度快。

技術領域

本發明屬于生物分析領域，具體涉及快速測定人血漿中麻痹性貝類毒素及河豚毒素類物質的檢測方法。

背景技術

河豚毒素類物質，主要包括河豚毒素(Tetrodotoxin,TTX)、11-oxTTX、11-deoxyTTX、11-norTTX-6(R)-ol、11-norTTX-6(S)-ol、4-epiTTX、4,9-anhydroTTX、5,6,11-trideoxyTTX、4-CysTTX、5-deoxyTTX、5,11-dideoxyTTX和6,11-dideoxyTTX等。屬于強毒性的非蛋白類的神經毒素，廣泛存在于河豚魚和一些兩棲動物體內。TTX類物質的中毒的程度與其攝入量、攝入后的時間和中毒前的健康狀況有關。作為一類強效毒素，可選擇性的阻斷鈉離子(NaV)通道，如NaV1.1、NaV1.2、NaV1.3、NaV1.6和NaV1.7，這些通道廣泛分布于人類的中樞和外周神經系統，通過阻斷神經沖動的傳導實現神經麻痹，被認為是很有前景的疼痛治療藥物。其中，研究最多的是TTX，有報道TTX對人的致死劑量估計為6～7μg/kg體重，在0.5μg/kg體重時血壓就會有下降趨勢。當TTX用于臨床治療時，其劑量遠低于LD50(小鼠腹腔注射的LD50為8μg/kg)，目前臨床試驗報告的給藥劑量為15-90μg(60kg/人)，血液中Cmax約為1ng/mL。

麻痹性貝類毒素(Paralytic shellfish toxins，PSTs)是一組天然的毒性生物堿，主要包括：石房蛤毒素(Saxitoxin，STX)、新石房蛤毒素(Neo-Saxitoxin，neo-STX)、脫氨甲酰基石房蛤毒素(Decarbamoyl saxitoxin，dc-STX)、漆溝藻毒素1～6(Gonyautoxin 1～6，GTX 1～6)、N-磺酰氨甲酰漆溝藻毒素2(N-Sulfocarbamoylgonyautoxin 2，C1)、N-磺酰氨甲酰漆溝藻毒素3(N-Sulfocarbamoylgonyautoxin 3，C2)、脫氨甲酰基漆溝藻毒素2(Decarbamoyl gonyautoxin 2，dc-GTX 2)、脫氨甲酰基漆溝藻毒素3(Decarbamoylgonyautoxin 3，dc-GTX 3)等。主要來源于赤潮中的有毒藻類，其毒理與河豚毒素類物質相似，都可通過選擇性阻斷鈉離子通道，導致神經麻痹，甚至呼吸癱瘓。PSTs使人的中毒范圍在600～5000μM之間，致死劑量為3000～30000μM。根據基團的相似性可分為四類：氨基甲酸酯類毒素、N-磺酰胺甲酰基類毒素、脫胺甲酰基類毒素和脫氧甲酰基類毒素。近年來發現其與TTX類物質常在貝類動物中被檢出，因此，為了確保患者的安全，并了解藥物濃度與療效之間的關系，亟需一種靈敏、準確和可靠的檢測方法同時監測人體血液中TTX類物質和PSTs的水平。

目前，測定TTX類物質和PSTs的方法有小鼠生物法、液相熒光法、酶聯免疫吸附法和液相色譜-串聯質譜法等。然而，小鼠生物法需針對特定動物檢測，且前處理繁瑣，重復性差；液相熒光法雖然操作簡便，但靈敏度低、專一性差。酶聯免疫吸附法靈敏度高、特異性強，但前處理復雜，反應耗時長，操作難度較大。與前幾種方法相比，液相色譜-串聯質譜法是最有優勢的技術，它具有特異性好、靈敏度高的特點，可以更快速、精準的測定人血液中TTX類物質和PSTs的濃度，從而為臨床診斷提供更高效、準確的判斷依據。但該技術仍有很大挑戰，主要在于前處理方法的富集效果不佳和去干擾能力差。