[發(fā)明專利]一種檢測抗重組人GLP-1-Fc融合蛋白抗體的方法

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• 申請日: 2022-09-30
• 公開（公告）號: CN115575468A
• 公開（公告）日: 2023-01-06
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 殷惠軍;郭春雨;周欽;伍洲;田莉;劉新明;阮灝;趙華南
• 申請（專利權(quán)）人: 華潤生物醫(yī)藥有限公司
• 主分類號: G01N27/26
• 分類號: G01N27/26;G01N21/76
• 代理公司: 北京三聚陽光知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11250
• 代理人: 張均瑩

1.一種檢測抗重組人GLP-1-Fc融合蛋白抗體的方法，其特征在于，包括：

(1)將待測樣品進(jìn)行酸化并孵育，然后進(jìn)行中和；

(2)向步驟(1)中和后的反應(yīng)液中加入含生物素標(biāo)記的GLP-1融合蛋白和電化學(xué)發(fā)光物質(zhì)標(biāo)記的GLP-1融合蛋白的工作液，并進(jìn)行孵育；

(3)將步驟(2)中孵育后的反應(yīng)液加入包被鏈霉親和素的微孔板中，封板后孵育，隨后洗板；

(4)向步驟(3)中洗板后的微孔板中加入讀板緩沖液，進(jìn)行電化學(xué)發(fā)光檢測。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測抗重組人GLP-1-Fc融合蛋白抗體的方法，其特征在于，在步驟(1)中，在酸化步驟中，將待測樣品與酸性溶液按照體積比1:4混合；和/或

在步驟(1)中，在酸化步驟中，采用的酸性溶液為300mM的乙酸溶液。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的檢測抗重組人GLP-1-Fc融合蛋白抗體的方法，其特征在于，

在步驟(1)中，在中和步驟中，采用濃度為1M、pH為9.5的Tris-HCl溶液為中和液進(jìn)行中和；

可選的，待測樣品、酸性溶液和中和液的體積比為20:80:30。

4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的檢測抗重組人GLP-1-Fc融合蛋白抗體的方法，其特征在于，在步驟(2)中，含生物素標(biāo)記的GLP-1融合蛋白和電化學(xué)發(fā)光物質(zhì)標(biāo)記的GLP-1融合蛋白的工作液中，生物素標(biāo)記的GLP-1融合蛋白濃度為0.5μg/mL，電化學(xué)發(fā)光物質(zhì)標(biāo)記的GLP-1融合蛋白的濃度為0.5μg/mL。

5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項所述的檢測抗重組人GLP-1-Fc融合蛋白抗體的方法，其特征在于，

在步驟(2)中，待測樣品和含生物素標(biāo)記的GLP-1融合蛋白和電化學(xué)發(fā)光物質(zhì)標(biāo)記的GLP-1融合蛋白的工作液的體積比為1:5；和/或

在步驟(2)中，電化學(xué)發(fā)光物質(zhì)標(biāo)記的GLP-1融合蛋白中的電化學(xué)發(fā)光物質(zhì)為釕。

6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項所述的檢測抗重組人GLP-1-Fc融合蛋白抗體的方法，其特征在于，

所述孵育步驟中，孵育的條件為于室溫下，500rpm孵育50-70分鐘。

7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項所述的檢測抗重組人GLP-1-Fc融合蛋白抗體的方法，其特征在于，所述洗板步驟中，采用洗液按照300μL/孔洗板3次；和/或

所述洗液為含0.05v/v％Tween 20的1×PBS。

8.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項所述的檢測抗重組人GLP-1-Fc融合蛋白抗體的方法，其特征在于，在步驟(3)中，在向包被鏈霉親和素的微孔板中加入步驟(2)中孵育后的反應(yīng)液之前，還包括對包被鏈霉親和素的微孔板進(jìn)行封閉，按照150μL/孔加入分析緩沖液，封板，然后于室溫條件下500rpm振蕩孵育1-3h，隨后采用洗液按照300μL/孔洗板3次；和/或

在步驟(3)中，將步驟(2)中孵育后的反應(yīng)液按照100μL/孔加入包被鏈霉親和素的微孔板中。

9.根據(jù)權(quán)利要求1-8任一項所述的檢測抗重組人GLP-1-Fc融合蛋白抗體的方法，其特征在于，在步驟(4)中，向步驟(3)中洗板后的微孔板中按照150μL/孔加入讀板緩沖液，施加電壓，在15分鐘內(nèi)讀板，根據(jù)獲得的電化學(xué)發(fā)光信號對抗重組人GLP-1-Fc融合蛋白抗體進(jìn)行定性檢測。

10.根據(jù)權(quán)利要求1-9任一項所述的檢測抗重組人GLP-1-Fc融合蛋白抗體的方法，其特征在于，

所述定性檢測：通過測試一批個體血清確定閾值，檢測到電化學(xué)發(fā)光信號在閾值以上，則認(rèn)為待測樣品中抗重組人GLP-1-Fc融合蛋白抗體陽性；檢測到電化學(xué)發(fā)光信號在閾值以下，則待測樣品中抗重組人GLP-1-Fc融合蛋白抗體陰性；

可選的，所述閾值包括初篩閾值、確認(rèn)閾值或內(nèi)源性GLP-1確認(rèn)閾值；

可選的，通過初篩閾值判定樣品，通過測試一批個體血清確定初篩閾值，當(dāng)檢測到待測樣品的S/N值≥初篩閾值因子，則認(rèn)為待測樣品中抗重組人GLP-1-Fc融合蛋白抗體初篩陽性；檢測到待測樣品的S/N值＜初篩閾值因子，則待測樣品中抗重組人GLP-1-Fc融合蛋白抗體初篩陰性；樣品的S/N值＝樣品信號值/陰性質(zhì)控樣品NC的信號值；

可選的，通過確認(rèn)閾值判定樣品，將步驟(2)中加入的含生物素標(biāo)記的GLP-1融合蛋白和電化學(xué)發(fā)光物質(zhì)標(biāo)記的GLP-1融合蛋白的工作液替換為含生物素標(biāo)記的GLP-1融合蛋白、釕標(biāo)記的GLP-1融合蛋白和重組人GLP-1融合蛋白的抑制工作液，然后通過測試一批個體血清確定確認(rèn)閾值，當(dāng)檢測到的信號抑制率≥確認(rèn)閾值，則認(rèn)為待測樣品中抗重組人GLP-1-Fc融合蛋白抗體確認(rèn)陽性；檢測到信號抑制率＜確認(rèn)閾值，則待測樣品中抗重組人GLP-1-Fc融合蛋白抗體確認(rèn)陰性，信號抑制率＝(平均信號值不加藥-平均信號值加藥)/平均信號值不加藥×100％；平均信號值不加藥即為陰性質(zhì)控樣品NC平均信號值，平均信號值加藥即為樣品的平均信號值；

可選的，通過內(nèi)源性GLP-1確認(rèn)閾值判定樣品，在步驟(2)中加入的含生物素標(biāo)記的GLP-1融合蛋白和電化學(xué)發(fā)光物質(zhì)標(biāo)記的GLP-1融合蛋白的工作液替換為含生物素標(biāo)記的GLP-1融合蛋白、釕標(biāo)記的GLP-1融合蛋白和內(nèi)源性GLP-1的工作液，然后通過測試一批個體血清確定內(nèi)源性GLP-1確認(rèn)閾值，當(dāng)檢測到信號抑制率≥內(nèi)源性GLP-1確認(rèn)閾值，則認(rèn)為待測樣品中抗重組人GLP-1-Fc融合蛋白抗體確認(rèn)GLP-1交叉反應(yīng)陽性；檢測到信號抑制率＜確認(rèn)閾值，則待測樣品中抗重組人GLP-1-Fc融合蛋白抗體確認(rèn)GLP-1交叉反應(yīng)陰性；信號抑制率＝(平均信號值不加藥-平均信號值加藥)/平均信號值不加藥×100％；平均信號值不加藥即為陰性質(zhì)控樣品NC平均信號值，平均信號值加藥即為樣品的平均信號值。