[發明專利]一種基于RT-RAA和CRISPR/Cas12a的人鼻病毒A型和C型檢測體系

在審

• 申請號: 202211211966.0
• 申請日: 2022-09-30
• 公開（公告）號: CN115838834A
• 公開（公告）日: 2023-03-24
• 發明（設計）人: 李永東;張丹丹;徐榮;焦素黎;倪紅霞
• 申請（專利權）人: 寧波市疾病預防控制中心
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11;C12N15/113;C12R1/93
• 代理公司: 溫州市品創專利商標代理事務所(普通合伙) 33247
• 代理人: 劉成文

本發明公開了一種基于RT?RAA和CRISPR/Cas12a的人鼻病毒A型和C型檢測體系，包括反轉錄重組聚合酶擴增體系和CRISPR/Cas12a切割體系，所述RT?RAA等溫擴增體系包括人鼻病毒A型和C型的RT?RAA引物對、RNase抑制劑、模板RNA、無核酸酶水、緩沖液和醋酸鎂；所述CRISPR/Cas12a切割體系包括：針對人鼻病毒A型和C型的特異性crRNA、Cas12a蛋白、ssDNA報告分子、NEB2.1緩沖體系、RNase抑制劑和無核酸酶水；所述特異性crRNA為針對人鼻病毒A型和C型保守序列片段設計合成；所述ssDNA報告分子包括用于酶標儀熒光檢測的ssDNAFAMreporter，實時熒光檢測器或用于免疫膠體金試紙條檢測的ssDNALFAreporter。本發明具有靈敏度高、特異性強、耗時短，適用于對人鼻病毒A型和C型的現場快速高靈敏檢測。

技術領域

本發明涉及一種檢測體系、方法以及用途，特別涉及一種基于RT-RAA和CRISPR/Cas12a的人鼻病毒A型和C型檢測體系、方法以及用途。

背景技術

人鼻病毒(human rhinovirus，HRV)血清型已經超過120多種。人鼻病毒是一種無包膜、單股正鏈RNA病毒，基因組大約7200bp，屬于小核糖核酸病毒科腸病毒屬。人鼻病毒A型和C型被認為是兒童呼吸道病毒感染的主要致病病毒，可導致三分之二的普通感冒以及與哮喘惡化和呼吸困難等慢性肺病的病因。該病毒主要感染對象是嬰幼兒和學前兒童，以及免疫力低下的人群。該病毒主要流行季節是春季和秋季，主要臨床癥狀為鼻塞、打噴嚏、頭痛、輕度喉嚨痛、發燒以及下呼吸道疾病。該病毒變異快、環境抵抗力強、感染劑量低，感染后潛伏期短、排毒時間長、免疫保護時間短，且傳播途徑多樣。因此，人鼻病毒具有高度傳染性和快速傳播能力。其中，鼻病毒A型和C型為最常見的致人感冒及其他下呼吸道相關疾病的鼻病毒亞型。目前，針對人鼻病毒A型或C型尚無特效的抗病毒藥物和疫苗，其預防控制主要利用非藥物性預防措施。因此，及時有效地檢測患者是否感染鼻病毒A型或C型，對臨床早期診斷和精準防控具有重要意義，且病原體的檢測是疾病確診的前提條件。

目前人鼻病毒A型和C型檢測的方法主要有病毒分離培養法、免疫學方法和核酸檢測法。病毒分離培養法雖有“金標準”之稱，但其操作復雜，耗時長，且成本較高，不適合早期診斷；免疫學方法是目前最為廣泛的技術，但由于人鼻病毒A、C血清型較多及缺乏常見的群抗原，所以抗原檢測和血清學檢測無法大規模使用；核酸檢測最常用的分子診斷方法為實時熒光定量PCR(RT-qPCR)技術，但該方法需要昂貴的特殊設備及專業人員。

CRISPR-Cas(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPRs)是細菌中一種適應性免疫系統，Cas蛋白通過RNA引導的核酸酶靶向降解外來靶標核酸。其中，CRISPR/Cas9蛋白家族已被廣泛應用到基因編輯、抗病毒制劑和生物影像等眾多領域。CRISPR/Cas12a屬于Cas酶第二家族，用來引導RNA指導雙鏈DNA裂解單個RuvC催化結構域。CRISPR/Cas12a酶識別富含胸腺嘧啶核苷酸的間隔區相鄰基序(PAM)，催化它們自身的指導CRISPR RNA(crRNA)成熟，并產生具有交錯5'的PAM遠端dsDNA斷裂和3'端不通順。當CRISPR/Cas12a蛋白以序列特異性方式切割雙鏈DNA時，能誘導強大的非特異性單鏈DNA(ssDNA)反式切割活性。基于CRISPR/Cas12a上述特性，我們開發了一種快速準確的鼻病毒A和C型檢測方法。從待檢臨床樣品中提取基因組DNA，并在等溫條件下進行基礎型逆轉錄等溫擴增(RT-RAA)。CRISPR/Cas12a-crRNA復合物結合靶標DNA，其介導CRISPR/Cas12a對ssDNA的切割活性。此外，與ssDNA偶聯的熒光報告分子在切割時產生熒光信號，或熒光素與生物素分離呈游離態，可通過膠體金試紙條檢測結果。