[發(fā)明專利]通過(guò)熒光免疫層析檢測(cè)技術(shù)測(cè)定單克隆抗體親和力的方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202211209890.8
• 申請(qǐng)日: 2022-09-30
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN115524481A
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-12-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 許行尚;杰弗瑞·陳;朱道云;王星強(qiáng)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南京嵐煜生物科技有限公司;江蘇華控生物科技有限公司
• 主分類號(hào): G01N33/533
• 分類號(hào): G01N33/533;G01N33/577
• 代理公司: 南京正聯(lián)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 32243
• 代理人: 顧伯興

1.一種通過(guò)熒光免疫層析檢測(cè)技術(shù)測(cè)定單克隆抗體親和力的方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1：制備熒光標(biāo)記物并標(biāo)記待測(cè)抗體，獲得熒光標(biāo)記抗體溶液；

S2：抗原與羊抗雞IgY分別包被在硝酸纖維素膜上的檢測(cè)線與質(zhì)控線；

S3：稀釋抗原，建立梯度稀釋的抗原溶液；稀釋好的抗原溶液分別加入熒光標(biāo)記抗體溶液，混勻后靜置，獲得混合物；

S4：將步驟S3中獲得的混合物進(jìn)行反應(yīng)測(cè)試并獲得測(cè)試結(jié)果；

S5：對(duì)測(cè)試結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，獲得擬合曲線，計(jì)算獲得抗體的解離常數(shù)，其倒數(shù)即為抗體的親和力常數(shù)數(shù)值。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的通過(guò)熒光免疫層析檢測(cè)技術(shù)測(cè)定單克隆抗體親和力的方法，其特征在于，所述步驟S1具體步驟為：

S11制備熒光標(biāo)記物：對(duì)熒光微球顆粒進(jìn)行清洗、活化，獲得熒光標(biāo)記物；S12標(biāo)記待測(cè)抗體：活化后的熒光微球與抗體偶聯(lián)，封閉，獲得熒光標(biāo)記抗體溶液。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的通過(guò)熒光免疫層析檢測(cè)技術(shù)測(cè)定單克隆抗體親和力的方法，其特征在于，所述步驟S11的具體步驟為：

S111清洗熒光微顆粒：檢查熒光微球顆粒的狀況，用移液器取熒光微球顆粒吹打混勻，加入干凈的離心管中，再加入PB緩沖液，進(jìn)行離心后去除上層清液；

S112活化：將清洗后的熒光微球顆粒復(fù)溶混勻并超聲，加入活化液后震蕩混勻，再超聲，進(jìn)行活化反應(yīng)，清洗并離心獲得活化后的熒光微球顆粒。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的通過(guò)熒光免疫層析檢測(cè)技術(shù)測(cè)定單克隆抗體親和力的方法，其特征在于，所述步驟S12的具體步驟為：

S121偶聯(lián)：將活化后的熒光微球顆粒與抗體進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)；

S122封閉：將偶聯(lián)反應(yīng)后的熒光微球顆粒采用封閉液進(jìn)行封閉，后采用保存液進(jìn)行保存，待用。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的通過(guò)熒光免疫層析檢測(cè)技術(shù)測(cè)定單克隆抗體親和力的方法，其特征在于，所述步驟S2的具體步驟為：

S21：配制膜包被液；

S22：將抗原與羊抗雞IgY分別添加在膜包被液中，并包被在硝酸纖維素膜上，標(biāo)記為檢測(cè)線與質(zhì)控線，45℃過(guò)夜烘干。

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的通過(guò)熒光免疫層析檢測(cè)技術(shù)測(cè)定單克隆抗體親和力的方法，其特征在于，所述步驟S3的具體步驟為：取10mL的PBS，梯度稀釋抗原，建立濃度為0.1nmol/L-1μmol/L的抗原溶液，分別加入熒光微球顆粒標(biāo)記好的抗體溶液混勻靜置15-30min。

7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的通過(guò)熒光免疫層析檢測(cè)技術(shù)測(cè)定單克隆抗體親和力的方法，其特征在于，所述步驟S5的具體步驟為：將記錄的測(cè)試結(jié)果的熒光值，結(jié)合梯度稀釋的抗原濃度繪制擬合曲線，獲得最強(qiáng)信號(hào)一半的點(diǎn)，即對(duì)應(yīng)的抗原濃度即解離常數(shù)Kd。

8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的通過(guò)熒光免疫層析檢測(cè)技術(shù)測(cè)定單克隆抗體親和力的方法，其特征在于，所述步驟S111具體為：

S1111：用移液器取熒光微球顆粒吹打混勻，加入干凈的離心管中；

S1112：加入熒光微球顆粒的兩倍體積的PB緩沖液，于4℃的高速冷凍離心機(jī)中進(jìn)行離心，轉(zhuǎn)速為16000rpm/min，離心15min后，用移液器輕輕吸取上清液并去除，獲得清洗后的熒光微球顆粒。