[發(fā)明專利]一種適用于小鼠肝臟單細(xì)胞測序的低溫解離方法

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• 申請日: 2022-09-30
• 公開（公告）號: CN115466714A
• 公開（公告）日: 2022-12-13
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 蔣建國;陳志鋒;梁洪
• 申請（專利權(quán)）人: 杭州聯(lián)川生物技術(shù)股份有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12Q1/6869
• 代理公司: 杭州信與義專利代理有限公司 33450
• 代理人: 馬育妙

本發(fā)明公開了一種適用于小鼠肝臟單細(xì)胞測序的低溫解離方法，包括收獲新鮮的肝臟組織進(jìn)行處理；后放入到加有地衣芽孢桿菌蛋白酶混合物的培養(yǎng)皿中解離；并在2?6℃環(huán)境下孵育，得到組織勻漿；將組織勻漿過細(xì)胞篩，用DMEM或1640培養(yǎng)基沖洗過濾器并停止酶活性，得到細(xì)胞懸液；將細(xì)胞懸液進(jìn)行離心，去上清液；并用含胎牛血清的DMEM或1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，然后過細(xì)胞篩；收集細(xì)胞沉淀，使用DPBS重懸細(xì)胞，即可得到解離后的肝臟單細(xì)胞。本發(fā)明提供的一種適用于小鼠肝臟單細(xì)胞測序的低溫解離方法，解決了傳統(tǒng)的“熱解離”實驗方法造成的肝實質(zhì)細(xì)胞死亡，留存的細(xì)胞中有大量的應(yīng)激基因表達(dá)等問題。該方法具有較好的技術(shù)表現(xiàn)，方便有效，適于推廣應(yīng)用。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種適用于小鼠肝臟單細(xì)胞測序的低溫解離方法。

背景技術(shù)

制備單細(xì)胞懸液是實體組織開展單細(xì)胞測序的關(guān)鍵實驗步驟，選擇消化酶用于制備單細(xì)胞懸液時，酶解溫度、酶活強度、酶濃度以及孵育時間是最重要的幾個因素，幾個因素的變化可能導(dǎo)致細(xì)胞活性、細(xì)胞產(chǎn)量、細(xì)胞完整性以及基因表達(dá)完整性的波動。目前應(yīng)用比較廣泛的實驗方法是“熱解離”法，即在30～37℃的孵育條件進(jìn)行組織解離。然而研究人員開始關(guān)注到“熱解離”方式可能會帶來的問題，如造成基因表達(dá)偽影(Artifacts)(AdamM,et al.2017)；誘導(dǎo)即時早期反應(yīng)基因(IEGs，如Fos、Jun或其他激活蛋白相關(guān)基因)、轉(zhuǎn)錄因子或者熱休克蛋白(HSPs)的非自然狀態(tài)表達(dá)(Denisenko E,et al.2020)；損失一些細(xì)胞類型，如神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞(Mattei D,et al.2020)；改變細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)模式等(Mattei D,et al.2020)。尤其是肝臟組織，由于肝實質(zhì)細(xì)胞對于熱溫度下的酶耐受性非常差，因此在肝臟常規(guī)解離方法中，有非常多的肝實質(zhì)細(xì)胞死亡，造成肝臟的單細(xì)胞測序無法捕獲到肝實質(zhì)細(xì)胞，而且留存的細(xì)胞中有大量的應(yīng)激基因表達(dá)的情況?；谝陨媳尘?，有必要建立一種新的組織解離實驗方法，解決“熱解離”法造成的問題。

目前尚未有成熟有效的組織解離方法，來解決細(xì)胞懸液中基因表達(dá)擾動、應(yīng)激基因非自然狀態(tài)表達(dá)、解離細(xì)胞偏好性等問題?，F(xiàn)有的解離酶，如胰蛋白酶、膠原酶、中性蛋白酶等，均是在30℃左右發(fā)揮最高的酶解效率，繞不開熱刺激這一難題。較低的孵育溫度會降低酶的反應(yīng)速度從而延長酶解時間，但低溫孵育可以減少細(xì)胞死亡，以及降低高溫孵育對細(xì)胞的刺激。

發(fā)明內(nèi)容

針對目前所存在的技術(shù)問題，本發(fā)明的目的在于提供一種適用于小鼠肝臟單細(xì)胞測序的低溫解離方法。

本發(fā)明提出的基于小鼠肝臟單細(xì)胞測序的低溫解離方法，對于解決以上問題具有較好的表現(xiàn)?！袄浣怆x”的解決方案可以在4℃甚至更低的溫度條件下，細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄活性處于休眠狀態(tài)，因此細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)就被“凍結(jié)”了，這就解決了由于以往熱解離環(huán)境造成的細(xì)胞死亡和基因表達(dá)模式改變的問題。“冷解離”要求酶在低溫條件下依然保持較高的活性，從嗜冷微生物中純化的蛋白酶(喜馬拉雅冰川常駐細(xì)菌地衣芽孢桿菌中分離的絲氨酸蛋白酶，地衣芽孢桿菌蛋白酶A)滿足了“冷解離”對于酶的要求。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)手段：

一種適用于小鼠肝臟單細(xì)胞測序的低溫解離方法，包括以下步驟：

S1，收獲新鮮的肝臟組織，通過門靜脈灌注預(yù)冷的1×PBS，使組織中的血液隨灌注液全部流出；其中，PBS在4℃下預(yù)冷，灌注的量為3-5mL；

S2，后通過門靜脈繼續(xù)灌注預(yù)冷的地衣芽孢桿菌蛋白酶混合物；其中，地衣芽孢桿菌蛋白酶混合物由地衣芽孢桿菌蛋白酶A(VIII型)，溶解于不含鈣鎂離子的磷酸鹽緩沖溶液(DPBS)中得到，濃度為100mg/mL，PH為8.0；地衣芽孢桿菌蛋白酶混合物在4℃下預(yù)冷，灌注的量為3-5mL；

S3，取出灌注后的肝臟組織，放入到加有地衣芽孢桿菌蛋白酶混合物的培養(yǎng)皿中，并用刀片將肝臟組織切碎，得到解離混合液；整個過程中培養(yǎng)皿均置于4℃冰上；