[發(fā)明專利]一種SINV感染性載體及其在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202211207752.6
• 申請(qǐng)日: 2022-09-30
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN116179602A
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-05-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 賈凡;施祥瑋;徐富強(qiáng)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院
• 主分類號(hào): C12N15/86
• 分類號(hào): C12N15/86;C12N15/27;C12N5/10;C12N7/01;A61K38/19;A61P35/00
• 代理公司: 廣州市華學(xué)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44245
• 代理人: 于波

本發(fā)明公開(kāi)了一種SINV感染性載體及其在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，所述SINV感染性載體以pSINV為骨架載體，在所述骨架載體上連接有粒細(xì)胞?巨噬細(xì)胞集落刺激因子GM?CSF。本發(fā)明的SINV感染性載體能夠更加穩(wěn)定地表達(dá)插入的外源基因，且病毒生物學(xué)特性與野生型相比無(wú)顯著性差異；本發(fā)明的SINV病毒顆粒能夠在宮頸癌Hela腫瘤細(xì)胞和肝癌Hep3B腫瘤細(xì)胞內(nèi)復(fù)制、選擇性地感染腫瘤細(xì)胞，并在免疫缺陷小鼠模型中實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤的殺傷作用，對(duì)于宮頸癌和肝癌的溶瘤治療等應(yīng)用性研究和基礎(chǔ)性研究具有重要的現(xiàn)實(shí)意義和廣泛的應(yīng)用價(jià)值。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種SINV感染性載體及其在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

目前針對(duì)癌癥治療的傳統(tǒng)技術(shù)手段主要是手術(shù)治療、化療、放療等，這些方法雖然能在一定程度上控制腫瘤生長(zhǎng)，但也存在一定的局限性。手術(shù)治療往往不能完全清除腫瘤細(xì)胞，術(shù)后傷口愈合的反應(yīng)還可能導(dǎo)致轉(zhuǎn)移性腫瘤的生長(zhǎng)；放療和化療容易引起腫瘤細(xì)胞的耐受和復(fù)發(fā)，導(dǎo)致預(yù)后不良。因此，迫切需要用于癌癥治療的新策略。

溶瘤病毒療法作為一種新型的腫瘤細(xì)胞生物療法，為惡性腫瘤的治療帶來(lái)了新的發(fā)展希望。溶瘤病毒能夠選擇性殺死腫瘤細(xì)胞，而對(duì)正常的組織和細(xì)胞無(wú)損傷作用。溶瘤病毒除了自身的殺傷腫瘤作用，還可以攜帶多種外源基因，實(shí)現(xiàn)生物調(diào)控作用，并且溶瘤病毒還可以誘導(dǎo)局部和全身的特異性抗腫瘤免疫，觸發(fā)機(jī)體內(nèi)獲得性免疫反應(yīng)和適應(yīng)性免疫反應(yīng)。

辛德畢斯病毒(Sindbis?virus，SINV)屬于披膜病毒科、甲病毒屬，其基因組為單股正鏈RNA，長(zhǎng)度約為12kb，共編碼5個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白(capsid、E3、E2、6K和E1)和4個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(NSP1、NSP2、NSP3和NSP4)。辛德畢斯病毒在自然界中主要是通過(guò)蚊蟲(chóng)叮咬在脊椎動(dòng)物，如鳥(niǎo)類、哺乳動(dòng)物中進(jìn)行傳播，具有廣泛的宿主范圍，包括人、鼠、猴等，這種感染特性可以使其成為介導(dǎo)外源基因到宿主體內(nèi)的載體。在腫瘤細(xì)胞內(nèi)復(fù)制、選擇性地感染腫瘤細(xì)胞繼而殺死腫瘤細(xì)胞的溶瘤病毒療法是目前最有希望的腫瘤免疫治療方法之一。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，本發(fā)明提出了一種穩(wěn)定表達(dá)GM-CSF的SINV感染性載體及其病毒顆粒和應(yīng)用，并評(píng)估該病毒顆粒在宮頸癌Hela小鼠皮下腫瘤模型和肝癌Hep3B小鼠皮下腫瘤模型中的效果。本發(fā)明在辛德畢斯病毒的NSP1基因中引入突變——在NSP1基因的853號(hào)核苷酸序列由G突變?yōu)锳，相應(yīng)的285號(hào)氨基酸序列由Gly突變?yōu)镾er，引入突變可以增加外源基因插入的穩(wěn)定性。本發(fā)明利用突變后的辛德畢斯病毒感染性載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞成功制備出能夠更加穩(wěn)定表達(dá)粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)基因的辛德畢斯病毒顆粒，并成功應(yīng)用于宮頸癌Hela小鼠模型和肝癌Hep3B小鼠模型的溶瘤治療。

本發(fā)明提供一種穩(wěn)定表達(dá)GM-CSF的SINV感染性載體，所述SINV感染性載體以pSINV為骨架載體，在所述骨架載體上連接有粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子GM-CSF；所述SINV感染性載體上依次連接有UBC啟動(dòng)子、5’UTR、NSP1基因的核苷酸序列、NSP2基因的核苷酸序列、NSP3基因的核苷酸序列、NSP4基因的核苷酸序列、C基因的核苷酸序列、E3基因的核苷酸序列、E2基因的核苷酸序列、6K基因的核苷酸序列、E1基因的核苷酸序列、GM-CSF基因的核苷酸序列、3’UTR。

進(jìn)一步的，所述NSP1基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.14所示。

進(jìn)一步的，所述SINV感染性載體的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.13所示。

本發(fā)明還提供一種辛德畢斯病毒顆粒的制備方法，使用所述的SINV感染性載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞。

進(jìn)一步的，所述細(xì)胞為BHK-21細(xì)胞。

本發(fā)明還提供一種辛德畢斯病毒顆粒，由所述的SINV感染性載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞后制備得到。

本發(fā)明還提供所述的辛德畢斯病毒顆粒在制備治療宮頸癌藥物中的應(yīng)用。