[發明專利]基于基因編輯技術的AhALS2突變型蛋白及其基因在花生育種中的應用

在審

• 申請號: 202211207692.8
• 申請日: 2022-09-30
• 公開（公告）號: CN115786297A
• 公開（公告）日: 2023-03-14
• 發明（設計）人: 張新友;石磊;黃冰艷;齊飛艷;張忠信;代小冬;秦利;劉華;韓鎖義;孫子淇;董文召
• 申請（專利權）人: 河南省農業科學院;神農種業實驗室
• 主分類號: C12N9/10
• 分類號: C12N9/10;C12N15/54;C12N15/82;A01H5/00;A01H6/54
• 代理公司: 鄭州市華翔專利代理事務所(普通合伙) 41122
• 代理人: 張愛軍

1.一種基于基因編輯技術的AhALS2突變型蛋白，其特征在于，所述AhALS2突變型蛋白包括Ah10ALS2突變蛋白或/和Ah20ALS2突變蛋白；

Ah10ALS2突變蛋白的氨基酸序列存在以下突變：其對應于擬南芥ALS蛋白197位氨基酸的脯氨酸變為絲氨酸、苯丙氨酸或天冬氨酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO：6～8；

Ah20ALS2突變蛋白的氨基酸序列存在以下突變：其對應于擬南芥ALS蛋白197位氨基酸的脯氨酸變為絲氨酸、或苯丙氨酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO：9～10。

2.一種編碼權利要求1所述AhALS2突變型蛋白的基因。

3.如權利要求2所述的基因，其特征在于，SEQ ID NO：6～8所示的Ah10ALS2突變蛋白的編碼基因的核苷酸序列分別如SEQ ID NO.1～3所示；SEQ ID NO：9～10所示的Ah20ALS2突變蛋白的編碼基因的核苷酸序列分別如SEQ ID NO.4～5所示。

4.如權利要求2或3所述的編碼AhALS2突變型蛋白的基因在花生育種中的應用。

5.利用如權利要求2或3所述的編碼AhALS2突變型蛋白的基因建立抗苯磺隆類除草劑花生新種質的方法。

6.如權利要求5所述的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)sgRNA靶點的確定：

sgRNA靶點覆蓋Ah10ALS2基因的第574位堿基和Ah20ALS2基因的第562位堿基，靶點序列3′端為PAM序列，所述靶點序列為5’-CAGGTCCCCCGCCGCATGATTGG-3’；

(2)制備oligo二聚體：

設計oligo序列引物Target-Sense和Target-Antisense，引物離心后，分別將引物用去離子水稀釋至濃度為10μM，各取1μL，加入18μL退火緩沖液，混勻；95℃保持3min后，以0.2℃/秒降溫速度緩慢降至20℃，在此溫度下保持5min，加水稀釋至100μL，完成oligo二聚體的制備；

(3)CRISPR-Cas9重組載體的構建：

選用pCSGAP01載體，加入bsal內切酶1μL，bsal內切酶的buffer緩沖液5μL，加水補齊至50μL，37℃酶切1h；回收酶切后的線性化載體2μL及infusion Enzyme Mix 1μL，加入合成的oligo二聚體1μL，在25℃反應1h；將連接后的載體轉化大腸桿菌感受態，挑取單克隆載體進行質粒測序，保存測序正確的陽性菌斑，得到CRISPR-Cas9重組載體質粒；

(4)花生的遺傳轉化：

以花生種子的胚芽為外植體，通過誘導獲得胚性愈傷，用基因槍轟擊法進行花生的遺傳轉化，經過潮霉素抗性篩選，獲得再生抗性愈傷，經過成苗誘導，獲得再生花生幼苗。

(5)突變植株鑒定：

鑒定再生花生幼苗植株是否發生預期位點的突變，保留突變株系，丟棄非突變株系；

(6)抗苯磺隆類除草劑的花生新種質的獲得：

選擇純合突變或雙等位突變的編輯植株進行繁殖，收獲下一代種子，即為抗苯磺隆類除草劑花生新種質。

7.如權利要求6所述的方法，其特征在于，所述引物Target-Sense和Target-Antisense的序列為：

Target-Sense：5'-TGTGTCAGGTCCCCCGCCGCATGAT-3'；

Target-Antisense：5'-AAACATCATGCGGCGGGGGACCTG-3'。

8.如權利要求6所述的方法，其特征在于，所述質粒測序的引物序列為pCBSG-seq:5’-TCCCAGTCACGACGTTGTAA-3’。

9.如權利要求6所述的方法，其特征在于，所述預期位點為Ah10ALS2基因的核苷酸序列的第574位發生C→T突變，或第574-575位發生CC→TT或CC→AA突變；或/和，Ah20ALS2基因的核苷酸序列的第562位發生C→T突變或第562-563位發生CC→TT突變。