[發明專利]一種提高mNGS細菌與真菌檢出率的去宿主方法及其應用

在審

• 申請號: 202211204020.1
• 申請日: 2022-09-29
• 公開（公告）號: CN115521875A
• 公開（公告）日: 2022-12-27
• 發明（設計）人: 王裴;劉菲菲;孫健;鄒小鳳;吳俊斌;梁智鋮;張磊;劉勇
• 申請（專利權）人: 廣州金域醫學檢驗中心有限公司
• 主分類號: C12N1/06
• 分類號: C12N1/06;C12N15/10;C12Q1/6806;C12Q1/6869
• 代理公司: 北京品源專利代理有限公司 11332
• 代理人: 趙穎

本發明提供了一種提高mNGS細菌與真菌檢出率的去宿主方法及其應用。所述方法包括：裂解人源細胞：采集待測樣本，采用Molzym試劑盒去宿主方法對待測樣本中的人源細胞進行裂解處理；裂解病原體細胞壁：對裂解人源細胞后的產物進行珠磨破碎，采用物理破碎的方式裂解病原體細胞壁，所述珠磨破碎處理的程序包括振蕩速度5.5?6.5m/s，振蕩時間28?32s，靜置4.5?5.5min，重復振蕩和靜置的步驟2?3次；核酸提取：對珠磨破碎后的產物進行核酸提取。本發明的去宿主方法與皂素法和Molzym試劑盒相比操作時間最短，對細菌和真菌的病原體檢出率最高；采用全自動提取儀減少人力及樣本間交叉污染，保證數據質量。

技術領域

本發明屬于生物檢測技術領域，具體涉及一種提高mNGS細菌與真菌檢出率的去宿主方法及其應用。

背景技術

宏基因組學在臨床應用上也有極好的前景，受到臨床、科研和檢驗等各個領域的重視。病原體宏基因組學高通量測序技術(mNGS)可以對疑似感染標本采集提取后直接進行高通量測序，規避了絕大部分微生物不能培養、痕量菌無法檢測的缺點，通過病原微生物專用數據庫比對和智能化算法分析，獲得疑似致病微生物的種屬信息，并提供全面深入的報告，為疑難危重感染提供快速精準診斷依據，促進抗生素類藥物合理使用。

然而即便有再強大的測序技術，也必須先從臨床樣本中提取出微量病原的核酸。臨床樣本形式種類繁多，病原微生物種類繁多，而樣本中由于可能存在大量宿主細胞或宿主的游離核酸，病原微生物核酸在提取出的核酸樣本中的豐度通常極低。因此，宿主核酸成為干擾mNGS的一大因素，在核酸提取環節，怎么樣做到有效去除宿主核酸，富集病原體核酸，進而提高mNGS的靈敏度也是難點之一。

目前，常用的去除人源宿主的方法有：過濾法、甲基化抗體捕獲法和選擇性裂解法。其中過濾法是基于病原體和宿主細胞體積差異進行去除，但由于真核細胞、寄生蟲等病原體和人類細胞體積大小近似，過濾法并不太常用。甲基化抗體捕獲通過人基因組核酸中廣泛存在的甲基化修飾對人的核酸進行去除，但是真菌、寄生蟲等真核病原體的核酸同樣具有甲基化，會在這一步驟中被去除，因此使用范圍受到較大限制。相比之下，選擇性裂解的原理是通過人細胞和病原體不同的理化性質，通過溫和的變性劑處理優先裂解人細胞(沒有細胞壁，較容易破裂)，再通過離心富集病原體。選擇性裂解法具有方便快捷、微生物損失小等優點，目前被廣泛采用。

但是選擇性裂解法耗時長，以Molyzym去宿主試劑為例，去宿主流程時間約為100分鐘，mNGS檢測多為ICU重癥病人，對TAT要求高，目前市場上去宿主試劑盒操作步驟多，耗時長。目前選擇性裂解法在裂解宿主核酸中存在一定弊端，裂解不足影響去宿主效果，裂解過度則容易降低病原體檢出率。選擇性裂解法找到平衡點，在保證去宿主效果同時提高病原體檢出率。

由于mNGS標本類型的多樣性，目前市場上缺乏自動去宿主的設備，大部分去宿舍試劑盒均采用手工去宿主和手工提取核酸結合的方法，如Molzym、Zymo等。手工提取核酸步驟繁瑣，耗費人力，容易導致樣本間交叉污染，不利于mNGS的結果判讀。因此，開發一種快速的病原微生物核酸提取方法，在病原體宏基因組學高通量測序領域具有重要的應用價值。

發明內容

針對現有技術存在的不足，本發明的目的在于提供一種提高mNGS細菌與真菌檢出率的去宿主方法及其應用。本發明創新地使用Molzym化學選擇性裂解法結合物理破碎(記為Quick BF法)，成功地達到較佳的去宿主效果并縮短實際操作時間，去宿主操作流程時間僅需27-38分鐘，遠遠低于市場上Zymo、Molzym、NEB等成品試劑盒所需時間，為重癥醫學mNGS的檢測爭取寶貴時間。

為達到此發明目的，本發明采用以下技術方案：

第一方面，本發明提供一種提高mNGS細菌與真菌檢出率的去宿主方法，所述方法包括如下步驟：

(1)裂解人源細胞：采集待測樣本，采用Molzym試劑盒去宿主方法對待測樣本中的人源細胞進行裂解處理；