[發明專利]一種多酶級聯制備L-乙烯基甘氨酸的方法

在審

• 申請號: 202211202374.2
• 申請日: 2022-09-29
• 公開（公告）號: CN115725668A
• 公開（公告）日: 2023-03-03
• 發明（設計）人: 龔大春;楊瀟;涂璇;呂育財;任立偉;郭金玲;萬里;胡慧琴
• 申請（專利權）人: 三峽大學
• 主分類號: C12P13/04
• 分類號: C12P13/04;C12N15/70;C12N1/21;C12N9/06;C12N9/88;C12N15/53;C12N15/60;C07K1/22;C07K1/18;C07K1/34;C07K1/36;C12R1/19
• 代理公司: 宜昌市三峽專利事務所 42103
• 代理人: 成鋼

本發明涉及一種多酶級聯制備L?乙烯基甘氨酸的方法，以蘇氨酸為原料，添加L?氨基酸氧化酶和/或D?氨基酸氧化酶進行生物催化反應得到β?羥基丁酮酸；β?羥基丁酮酸在乳酸脫水酶或苯基乳酸脫水酶的作用下，反應得到3?烯?丁酮酸；將制備得到的3?烯?丁酮酸中加入L?谷氨酸脫氫酶和葡萄糖脫氫酶，反應得到L?乙烯基甘氨酸。制得精細化工中間體L?乙烯基甘氨酸，總收率75%?90%，光學純度為99%以上。該中間體的合成，不用各氨基和羧基的各種保護，不用高溫和強酸。將L?乙烯基甘氨酸在冰醋酸條件下，與甲基亞磷酸乙酯加成反應后，經過酸解、氨中和、甲醇重結晶，可以得到光學純度大于99%，收率大于95%的精草銨膦。

技術領域

本發明屬于涉及精細化工、基因工程與酶工程領域，涉及一種多酶級聯制備L-乙烯基甘氨酸的方法及其在精草銨膦合成中的應用。

背景技術

L-乙烯基甘氨酸(Vinylglycine)的結構式如下所示，它是一種天然的、非蛋白氨基酸，是磷酸吡哆醛PLP輔酶抑制劑，也可以作為新型除草劑精草銨膦(L-草銨膦)的合成原料，L-乙烯基甘氨酸衍生物還可以作為延遲水果在冷藏和貨架期內果實品質和生物活性成分的損失保鮮劑，因此L-乙烯甘氨酸低成本高效合成至關重要。

目前L-乙烯基甘氨酸的合成主要是化學方法，酶法合成還未見報道。化學合成法以國外學者報道較多，其合成原料主要有蛋氨酸、高半胱氨酸，經過氨基和羧基保護后，經過脫水制備，總收率不到50％，主要過程如下所示：

由于化學法合成L-乙烯基甘氨酸的合成路線長、收率低、過程涉及高溫和危險化學品，對設備要求高，難于實現產業化。因此本發明采用生物催化劑，利用L-氨基酸氧化酶或D-氨基酸氧化酶先制備其β-羥基丁酮酸化合物，然后利用脫水酶制備對應的乙烯基丁酮酸，最后經過L-氨基酸脫氫酶和輔酶NADH或NADPH進行氨化還原制備出L-乙烯基甘氨酸，考慮到最后的產物對氨基酸氧化酶和脫水酶會產生一定的毒性，在工藝上將采用多酶級聯反應系統，本課題組申報了相應的專利(龔大春,王德林,張書銀.等人，多酶級聯反應分離耦合系統和方法，CN 113088443 A)，因此用多級聯反應酶高效合成L-乙烯基甘氨酸的方法尚未見報道，具有廣闊的應用前景。

發明內容

為解決上述化學合成的收率低、條件苛刻等技術問題，本發明提供一種多酶級聯制備L-乙烯基甘氨酸的方法，并應用在精草銨膦的合成中。

本發明的技術路線如下所示：

采用本發明的上述技術構思進行的多酶級聯制備L-乙烯基甘氨酸的方法包括如下步驟：

(1)以蘇氨酸為原料，添加L-氨基酸氧化酶或D-氨基酸氧化酶進行生物催化反應得到β-羥基丁酮酸。

為了保證氨基酸氧化酶的酶活力，選用緩沖溶液0.1-0.3mol/L Tris-HCl，在反應溫度為20-35℃，pH控制在5.5-7.5下進行，其中pH為中性環境如，6.5-7.0時具有更優選的催化效果。

(2)β-羥基丁酮酸在乳酸脫水酶或苯基乳酸脫水酶的作用下，反應得到3-丁酮酸；為了保證脫水酶的酶活，選用0.1-0.3mol/L Tris-HCl緩沖液，在反應溫度為15-35℃，pH控制在4.5-7，進一步優選為pH為5.5-6.5。

(3)將制備得到的3-烯-丁酮酸中加入L-谷氨酸脫氫酶和葡萄糖脫氫酶，反應得到L-乙烯基甘氨酸。

為了保證L-谷氨酸脫氫酶的酶活，選用0.1-0.3mol/L Tris-HCl緩沖液或磷酸鹽緩沖溶液，在反應溫度為25-55℃下，pH控制在6.5-8.5，進一步優選為pH為7.5-8.0。

所述的起始原料蘇氨酸為D型蘇氨酸、L型蘇氨酸、或DL型蘇氨酸。

1.1β-羥基丁酮酸所用的酶或酶制劑制備