[發明專利]一種高產神經酸的圓紅冬孢酵母工程菌株及其構建方法和應用

有效

• 申請號: 202211202178.5
• 申請日: 2022-09-29
• 公開（公告）號: CN116024109B
• 公開（公告）日: 2023-09-12
• 發明（設計）人: 蘇二正;劉飛翔;車梓研;馬曉強
• 申請（專利權）人: 南京林業大學
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/81;C12N15/53;C12N15/60;C12N15/54;C12P7/6427;C12R1/645
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 孫斌

本發明公開了一種高產神經酸的圓紅冬孢酵母工程菌株及其構建方法和應用，該工程菌株以圓紅冬孢酵母為出發菌株，異源表達不同底物偏好性的脂肪酸延伸酶復合物中的KCS酶；過表達脂肪酸延伸酶復合物中的KCR、HCD和ECR酶，以及蘋果酸酶ME1。本發明構建的高產神經酸的菌株，在50L發酵罐水平上，油脂和神經酸滴度分別達到73.7g/L和35.4g/L，具有潛在的工業化生產價值。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種高產神經酸的圓紅冬孢酵母工程菌株及其構建方法和應用。

背景技術

神經酸(Nervonic?acid，NA)，化學名為順-15-二十四碳一烯酸(cis-15-tetracosenic?acid)，作為一種超長鏈脂肪酸(Very?long?chain?fatty?acid,VLCFA)，是大腦神經組織和細胞中重要的營養物質，對于大腦組織發育、阿爾茨海默氏病、心腦血管疾病以及免疫系統性疾病等均有積極的治療和預防作用。

神經酸的特殊功效，使其一直以來是醫藥和保健食品領域的研究熱點之一。但目前神經酸的來源，依然主要來自于有限的植物資源，然而這些木本或草本植物，由于其對生長條件要求苛刻，無法像油菜等農作物那樣可高效產油脂或實現大規模廣泛的種植，因而導致神經酸供不應求，市場價格高昂。實現神經酸的工業化高效生產，可有效降低目前高昂的價格，使其成為人們日常飲食的一部分，從而為保障和改善民生水平做出一定貢獻。近些年，隨著代謝工程、系統生物學和合成生物學的發展，使得研究者們可采用生物技術的方法，以期實現神經酸的高效發酵生產以滿足未來市場的需求。

雖然采用植物基因工程的方法，可在油料作物中實現大量積累神經酸的目的。但是油料作物相對于微生物細胞而言，具有生長速度慢、占用耕地等缺點。因此采用微生物高產神經酸更具有可行性，而高產油脂的酵母是最好的宿主選擇之一。酵母中原有的FAE途徑中，相當于KCS的酶為Elo1、Elo2、Elo3，但其特異性底物均為飽和脂肪酸，所以酵母中的超長鏈脂肪酸產物一般為C20:0、C22:0、C24:0及C26:0等飽和脂肪酸。因此，若要在酵母中實現超長鏈不飽和脂肪酸的合成，就必須引入能以C18:1為特異性底物的KCS酶基因。國外Fillet等人，將不同底物偏好的KCS基因整合至R.toruloides中，最終使用C.abyssinica和C.graeca的KCS基因組合表達，使油脂中神經酸的組成比例達到16％左右(神經酸發酵滴度為7.9g/L)，但芥酸占比達到了近10％左右(FILLET?S,RONCHEL?C,CALLEJO?C,etal.Engineering?Rhodosporidium?toruloides?for?the?production?of?very?long-chain?monounsaturated?fatty?acid-rich?oils.Applied?Microbiology?andBiotechnology,2017,101(19):7271-7280)，這一工作總體來說神經酸滴度偏低，芥酸占比偏高，離工業化較遠。近年國內有關研究人員也已經在解脂耶羅維亞酵母(Yarrowialipolytica)中開展代謝工程改造合成神經酸的研究，趙晨等人報道的最高神經酸菌株，其神經酸占油脂的含量為6.4％，且將AtFAE1(AtKCS)、BtFAE1和CgKCS三種不同底物偏好的KCS組合表達時，未能進一步提高神經酸的產量(趙晨,孟慧敏,李家欣,張培玉,李福利,王士安.解脂耶羅維亞酵母工程菌合成超長鏈脂肪酸及溫度的影響.微生物學通報,2020,47(01):13-23)。綜上在，改造解脂耶羅維亞酵母產神經酸仍然面臨著滴度低和芥酸含量高等缺陷，無法達到產業化生產的目的，因此還需要開拓思路在其它宿主細胞中采取新的技術手段來解決這些問題。

發明內容

發明目的：針對現有技術中存在問題，本發明提供了一種高產神經酸的基因工程菌株，該基因工程菌株通過發酵可以穩定的高效合成富含神經酸的油脂。

本發明還提供所述高產神經酸的基因工程菌株的構建方法和應用。