[發(fā)明專利]一種競爭型中華鱘促黃體生成素檢測試劑盒及應用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202211185246.1
• 申請日: 2022-09-27
• 公開（公告）號: CN115980371A
• 公開（公告）日: 2023-04-18
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉香江;歐陽雨;呼光富;史雪濤;謝云軼;肖衎;舒婷婷;楊菁;杜合軍
• 申請（專利權(quán)）人: 華中農(nóng)業(yè)大學
• 主分類號: G01N33/76
• 分類號: G01N33/76;G01N33/532;C07K14/59;C12N15/70;C12N15/16;C07K16/26;C07K16/06
• 代理公司: 北京慕達星云知識產(chǎn)權(quán)代理事務所(特殊普通合伙) 11465
• 代理人: 田立媛

1.一種競爭型中華鱘促黃體生成素檢測試劑盒，其特征在于，包括中華鱘LH抗體、中華鱘LH蛋白標準品和LH示蹤劑；

所述中華鱘LH抗體為中華鱘重組LHβ蛋白經(jīng)動物免疫后獲得的多克隆抗血清純化制得；

所述中華鱘LH蛋白標準品為中華鱘重組LHβ蛋白；

所述LH示蹤劑為中華鱘重組LHβ蛋白經(jīng)生物素標記制得；

所述中華鱘重組LHβ蛋白氨基酸序列如SEQ?ID?NO：3所示：

LRLCEPVNETISAEKEECPKCLLIQTSICSGSCPTKDPVFKSALSTVQQHVCTYKDLRFVTVTLPDCPPGVDPHFTFPLALSCECSLCRMESSDCTIQSVGPSDCMSGELAIQNY。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種競爭型中華鱘促黃體生成素檢測試劑盒，其特征在于，

所述中華鱘重組LHβ蛋白的制備方法為：

(1)提取中華鱘垂體mRNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，PCR擴增LHβ亞基ORF區(qū)序列，雙酶切得LHβ雙酶切產(chǎn)物；

(2)雙酶切表達載體pET-28a+；

(3)將LHβ雙酶切產(chǎn)物與雙酶切后的pET-28a+表達載體進行連接，得原核表達重組質(zhì)粒pET-28a+-LHβ；

(4)將原核表達重組質(zhì)粒pET-28a+-LHβ轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細胞，經(jīng)誘導表達、純化獲得中華鱘重組LHβ蛋白。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種競爭型中華鱘促黃體生成素檢測試劑盒，其特征在于，

步驟(1)中，

PCR上游引物：5’-CCGGAATTCCTGCGCCTGTGTGAGCCGGTGA-3’，如SEQ?ID?NO.1所示；

PCR下游引物：5’-CCGCTCGAGTCAGTAGTTCTGTATGGCGAGC-3’，如SEQ?ID?NO.2所示；

PCR反應程序：

94℃預變性5min；

94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，35個循環(huán)；

72℃延伸5min；

步驟(2)(3)中，

所述雙酶切使用限制性內(nèi)切酶EcoR?I和Xho?I；

步驟(4)中，

所述誘導表達條件為：28℃，0.5mM?IPTG終濃度誘導表達8h。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種競爭型中華鱘促黃體生成素檢測試劑盒，其特征在于，

所述中華鱘LH抗體的制備方法：

1)將純化的中華鱘重組LHβ蛋白用PBS稀釋，再與弗氏佐劑混勻乳化，對家兔進行免疫，免疫完畢后，得兔抗LHβ多克隆抗血清；

2)利用蛋白A/G純化法對兔抗LHβ多克隆抗血清進行純化獲得中華鱘LH抗體；

所述中華鱘LH抗體儲存濃度為2mg/mL。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種競爭型中華鱘促黃體生成素檢測試劑盒，其特征在于，

所述中華鱘LH蛋白標準品使用時的濃度為500ng/mL、250ng/mL、125ng/mL、62.5ng/mL、31.25ng/mL、15.6ng/mL、7.8ng/mL、3.9ng/mL、1.95ng/mL、0.975ng/mL、0ng/mL。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種競爭型中華鱘促黃體生成素檢測試劑盒，其特征在于，

所述LH示蹤劑的制備方法：

將中華鱘重組LHβ蛋白與9mM的生物素按200μg：200μL比例混合均勻，再置于冰中2h，使用脫鹽柱進行純化；

所述LH示蹤劑儲存濃度為2mg/mL。