[發(fā)明專利]一種家豬精子金屬表面玻璃化凍融方法

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• 申請日: 2022-09-27
• 公開（公告）號: CN115369075A
• 公開（公告）日: 2022-11-22
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陳昱光;賀鑫
• 申請（專利權(quán)）人: 西北農(nóng)林科技大學(xué)
• 主分類號: C12N5/076
• 分類號: C12N5/076;A01N1/02
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冷凍保存的家豬精液具有安全、靈活和能長期靜態(tài)保種等優(yōu)勢，但傳統(tǒng)方法制備的家豬凍精，復(fù)蘇后的質(zhì)量遠(yuǎn)低于牛、羊等其他大型牲畜，妨礙了豬精液冷凍保存技術(shù)的廣泛應(yīng)用。本發(fā)明建立和優(yōu)化了金屬表面玻璃化凍融方法，通過加快降溫和升溫速度、并在冷凍和融化配方中添加依布硒，減少精子懸液的冷凍和融化時間使之快速玻璃化，進(jìn)而減少了精子膜結(jié)構(gòu)的相分離和氧化變性，提高了精液抗凍性能，使凍融后的家豬精子受精性能得到極大的提高，能夠滿足家豬人工授精使用，具有在產(chǎn)業(yè)中推廣應(yīng)用的價值。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種家豬精子金屬表面玻璃化凍融方法。

背景技術(shù)

人工授精是目前養(yǎng)豬業(yè)中應(yīng)用最廣泛的豬育種技術(shù)，考慮到繁殖性能，人工授精主要使用液體儲存的精液（包括低溫保存的精液）；但這一技術(shù)手段存在保存時間較短等問題，因此難以用于大規(guī)模的遠(yuǎn)距離協(xié)同和種公豬遺傳資源長期保存。相較于液體保存的精液，超低溫冷凍保存的精液具有生物安全性、使用的靈活性、保種能力以及國際貿(mào)易的優(yōu)勢；因此在理想情況下，冷凍保存的精液是家豬授精的第一選擇。

然而相比于其它哺乳動物，家豬精子有頭部體積大、膜不飽和脂肪酸含量多的特點(diǎn)，存在冷休克現(xiàn)象，導(dǎo)致其它動物的凍精技術(shù)無法改進(jìn)推廣到家豬精子上，因為冷凍復(fù)蘇后豬精子復(fù)蘇率和質(zhì)量遠(yuǎn)低于牛、羊等其他大型牲畜，這導(dǎo)致了在實(shí)際生產(chǎn)中出現(xiàn)受精率極低的問題。總之，目前基于其它哺乳動物的精子凍存技術(shù)方案和相應(yīng)配方，都不能在家豬精子上良好工作，因此基于精子冷凍保存的家豬擴(kuò)繁技術(shù)無法在實(shí)際生產(chǎn)中推廣應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所述家豬精子，指學(xué)名為Sus scrofa f. domestica的豬科、豬屬家畜雄性個體產(chǎn)生的雄配子（Sperm），文本中的精液指家豬射精后產(chǎn)生的由精子和精漿組成的特殊液體。

本發(fā)明所述精子超低溫保存特指如下技術(shù)方案：通過特定步驟、包括應(yīng)用與這些步驟配套的配方，處理精子或含精子液體，使其能夠在液氮等超低溫環(huán)境下長期保存，復(fù)蘇后仍有部分精子保持正常受精能力。

本發(fā)明所述依布硒（Ebselen），特指CAS登錄號為60940-34-3的小分子有機(jī)硒類化合物，其結(jié)構(gòu)如圖1所示。

本發(fā)明所述玻璃化冷凍金屬塊，所用金屬要求其導(dǎo)熱率大于200瓦特/米/開爾文，目前實(shí)驗發(fā)現(xiàn)的最佳選擇為純銅；玻璃化冷凍金屬塊體積應(yīng)大于實(shí)驗用到2毫升規(guī)格孔總體積的10倍以上。

發(fā)明人長期研究家豬精液冷凍復(fù)蘇過程中的分子機(jī)理發(fā)現(xiàn)，造成冷凍復(fù)蘇后家豬精子質(zhì)量遠(yuǎn)低于牛、羊等其他大型牲畜的主要原因是，相比其它哺乳動物，家豬精子大量利用不飽和脂肪酸代替膽固醇，以維持細(xì)胞膜的低溫穩(wěn)定性，然而不飽和脂肪酸雙鍵易遭受氧化損傷，特別是過氧化損傷產(chǎn)生的醛類還具有進(jìn)一步誘導(dǎo)脂質(zhì)氧化損傷的能力，形成了鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，并在鐵離子和亞鐵離子催化下產(chǎn)生羥自由基，進(jìn)一步加劇了細(xì)胞膜脂質(zhì)變質(zhì)，從細(xì)胞層面看，在凍存復(fù)蘇中失能的家豬精子經(jīng)歷了鐵死亡過程。另外凍存過程中膜不同組分的相分離和冰晶損傷，也是細(xì)胞膜變質(zhì)的重要原因。

但家豬精子中不飽和脂肪酸含量是由其物種特殊的遺傳特征決定的，難以通過常規(guī)手段改變其脂膜組分。鑒于此，發(fā)明人建立和優(yōu)化了金屬表面玻璃化冷凍(MetalSurface Vitrification, MSV)技術(shù)和相應(yīng)的凍存和復(fù)蘇液配方，通過一系列綜合手段加快降溫和升溫速度，減少家豬精子的冷凍和融化時間，使家豬精子的膜脂質(zhì)快速玻璃化，減少膜相分離和冰晶損傷；并利用依布硒來穩(wěn)定膜結(jié)構(gòu)并對抗脂質(zhì)過氧化，提高精液抗凍性能，使凍融后的精子保持一定活力，便于在生產(chǎn)中使用。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)實(shí)施方案做進(jìn)一步詳細(xì)說明。