[發明專利]一種谷氨酸脫羧酶突變體、基因及其應用

有效

• 申請號: 202211178637.0
• 申請日: 2022-09-27
• 公開（公告）號: CN116064494B
• 公開（公告）日: 2023-06-30
• 發明（設計）人: 呂常江;王東陽;劉樹立;戈連峰;陳正;黃俊
• 申請（專利權）人: 山東陽成生物科技有限公司;浙江科技學院
• 主分類號: C12N9/88
• 分類號: C12N9/88;C12N15/60;C12N15/70;C12N1/21;C12P13/00;C12R1/19
• 代理公司: 長沙準星專利代理事務所(普通合伙) 43241
• 代理人: 白甲坡

本發明公開了一種谷氨酸脫羧酶突變體、基因及其應用，屬于生物技術領域。該突變體的氨基酸序列如SEQ?ID?NO:4所示，核苷酸序列如SEQ?ID?NO:2所示。本發明通過祖先酶序列重建策略獲取了一個熱穩定性顯著提升的GAD突變體。與野生型相比，該突變體最適反應溫度提升了17℃；在55℃條件下的半衰期tsubgt;1/2/subgt;為321.4?min，是野生型GAD?23.7?min的13.6倍；突變體的Tsubgt;50/subgt;supgt;15/supgt;為60.1℃，比野生型的56.5℃提高了3.6℃；所述突變體熱穩定性顯著提升，具有大規模工業應用的前景。

技術領域

本發明涉及生物催化技術領域，尤其涉及一種谷氨酸脫羧酶突變體、基因及其應用。

背景技術

γ-氨基丁酸（GABA）是一種四碳非蛋白氨基酸，在動物、植物及微生物中廣泛存在。作為哺乳動物中樞神經系統中的重要抑制性神經遞質，GABA具有降血壓、利尿、抗抑郁、改善睡眠、促進生長及抗衰老等多種重要的生理功能，在醫藥及食品等領域具有廣闊的應用前景。谷氨酸脫羧酶（glutamic?acid?decarboxylase,?GAD;?EC?4.1.1.15）是生物法合成GABA的關鍵酶，其能夠以磷酸吡哆醛（PLP）為輔酶，專一、不可逆地催化L-谷氨酸或L-谷氨酸鈉脫去α-羧基生成GABA并釋放出CO₂。篩選或構建具有良好催化性能的GAD是實現生物法高效合成GABA的重要前提。

目前，來源于大腸桿菌、巨大芽孢桿菌、嗜熱鏈球菌、乳酸乳球菌、植物乳桿菌、短促生乳桿菌（原短乳桿菌）、清酒乳桿菌、米曲霉及綠色木霉等不同微生物染色體上的GAD基因被克隆和異源表達，其酶學性質亦被研究（Ning?Xu,?Liang?Wei??Jun?Liu.Biotechnological?advances?and?perspectives?of?gamma-aminobutyric?acidproduction,World?Journal?of?Microbiology?and?Biotechnology,?2017,?33:64）。然而，天然的GAD普遍存在熱穩定性差的缺陷。近年來，包括發明人在內的國內外研究者通過定點突變、脯氨酸效應、拉氏圖信息、同源建模、蛋白質表面電荷優化及序列一致性等方法在一定程度上提升了GAD的熱穩定性（申請號CN202010442372.5、CN202210086071.2、CN201910572205.X、CN201710196715.2、CN202110238958.4），但在大規模酶法合成GABA的工業應用中仍受到較大制約。因此，如何進一步提升GAD的穩定性具有重要的研究意義和應用價值。

發明內容

為解決谷氨酸脫羧酶穩定性差的問題，本發明提供了一種基于祖先酶序列重構策略的谷氨酸脫羧酶突變體以及制備方法和應用。與野生型GAD相比，其熱穩定型顯著提升。

本發明是通過如下技術方案來實現的：

本發明提供了一種谷氨酸脫羧酶突變體，其氨基酸序列如SEQ?ID?No.4所示，其野生蛋白為來源于短促生乳桿菌CGMCC?No.1306表達的酶，其氨基酸序列如SEQ?ID?No.3所示。

本發明提供了一種如上所述的谷氨酸脫羧酶突變體的編碼基因，其核苷酸序列如SEQ?ID?No.2所示，野生型谷氨酸脫羧酶的編碼基因如SEQ?ID?No.1所示。

本發明以前期晶體結構已解析的短促生乳桿菌源谷氨酸脫羧酶（GAD；PDB?ID:5GP4）為模板蛋白，基于祖先酶序列重構策略通過FireProt^ASR系統（https://loschmidt.chemi.muni.cz/fireprotasr/）構建GAD突變體，然后驗證突變體的熱穩定，得到了一個熱穩定性顯著提升的GAD突變體，命名為AncGAD。