[發(fā)明專利]一種基于多酶恒溫核酸快速擴增技術(shù)檢測金黃色葡萄球菌的試劑盒和方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202211167002.0
• 申請日: 2022-09-23
• 公開（公告）號: CN116064865A
• 公開（公告）日: 2023-05-05
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 何洋;衡鵬非;宋瑱
• 申請（專利權(quán)）人: 成都中醫(yī)藥大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6844;C12N15/11;C12R1/445
• 代理公司: 成都高遠知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 51222
• 代理人: 肖柯岑;張娟

本發(fā)明提供了一種能夠?qū)瘘S色葡萄球菌特異性靶基因進行高效擴增的引物對，序列分別如SEQ?ID?NO.1和SEQ?ID?NO.2所示；并且提供了金黃色葡萄球菌的特異性檢測探針，構(gòu)建了快速、準(zhǔn)確、有效地檢測金黃色葡萄球菌的多酶恒溫快速擴增(MIRA)檢測方法，檢測特異性和靈敏度高，具有推廣應(yīng)用價值。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于微生物分子診斷領(lǐng)域，具體涉及一種基于多酶恒溫核酸快速擴增技術(shù)檢測金黃色葡萄球菌的試劑盒和方法。

背景技術(shù)

金黃色葡萄球菌被認為是臨床上最重要的病原體之一。可引起各種感染，如腸炎，肺炎，心內(nèi)膜炎和菌血癥等。其可分泌多種毒力因子(腸毒素、溶血毒素、殺白細胞素、血漿凝固酶等)，具有很強的致病性。此外，臨床檢測金黃色葡萄球菌所需的時間和濫用抗生素導(dǎo)致對金黃色葡萄球菌的抗藥性逐漸增加。因此發(fā)展一種準(zhǔn)確篩查金黃色葡萄球菌感染的快速檢測方法對于預(yù)防感染和早期治療至關(guān)重要。

目前分離和鑒定金黃色葡萄球菌的標(biāo)準(zhǔn)臨床方法依賴于培養(yǎng)和顯微鏡。雖然這些方法穩(wěn)定、廉價，可以提供有關(guān)微生物數(shù)量和性質(zhì)的定性和定量信息，但它們耗時且操作復(fù)雜。這一過程從樣本采集、選擇性培養(yǎng)、生化篩選和血清學(xué)確認，大約需要2至5天，因此不適合及時診斷和治療。隨著分子診斷技術(shù)的進步，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)在細菌檢測上的應(yīng)用顯著改進了細菌檢測。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測需要2-3個小時。最近的研究已經(jīng)開發(fā)出新的有效的金黃色葡萄球菌檢測方法，例如環(huán)介導(dǎo)的等溫擴增(LAMP)、重組酶聚合酶擴增(RPA)/重組酶輔助擴增(RAA)、層析方法、免疫學(xué)方法和基于適體的方法。這些技術(shù)雖然能夠檢測到低數(shù)量的細菌細胞。然而，這些技術(shù)的廣泛應(yīng)用受到復(fù)雜儀器、復(fù)雜程序、高儀器成本等的限制。多酶恒溫快速擴增(Multienzyme?Isothermal?Rapid?Amplification，MIRA)是一種基于重組酶的新型恒溫擴增技術(shù)。與RPA(T4?UvsX)和RAA(E.coli?UvsX)不同的是它使用了不同來源的重組酶(天藍色鏈霉菌recA，SC-recA)，提高了反應(yīng)的穩(wěn)定性和抗干擾性。該反應(yīng)可在37-42℃的恒溫條件下進行，通過瓊脂糖凝膠電泳、實時熒光、膠體金試紙條等對結(jié)果進行判讀。

盡管MIRA技術(shù)有諸多優(yōu)勢，但目前，還未見利用基于MIRA技術(shù)對金黃色葡萄球菌進行快速檢測的引物、試劑和檢測方法報道。為了實現(xiàn)了簡便、快速、準(zhǔn)確地檢測出金黃色葡萄球菌的目的，研發(fā)能夠?qū)瘘S色葡萄球菌特異性靶基因進行高效擴增的引物序列和相應(yīng)的檢測探針，構(gòu)建金黃色葡萄球菌多酶恒溫快速擴增檢測的方法，具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種對金黃色葡萄球菌特異性靶基因進行高效擴增的引物序列和相應(yīng)的檢測探針，以及基于MIRA技術(shù)對金黃色葡萄球菌實現(xiàn)快速有效檢測的方法。

本發(fā)明提供了一種金黃色葡萄球菌基因擴增引物對，所述引物序列分別如SEQ?IDNO.1和SEQ?ID?NO.2所示。

本發(fā)明還提供了上述的引物對在多酶恒溫核酸快速擴增檢測金黃色葡萄球菌的試劑盒中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了一種基于多酶恒溫核酸快速擴增技術(shù)檢測金黃色葡萄球菌的試劑盒，其特征在于，包括權(quán)利要求1所述的引物對。

進一步地，上述試劑盒還包括檢測探針；所述檢測探針是有如下標(biāo)記的SEQ?IDNO.3所示序列：核酸外切酶識別位點、熒光報告基團、熒光淬滅基團和阻抑聚合酶延伸或擴增的基團。

更進一步地，上述核酸外切酶識別位點位于檢測探針序列中部，所述熒光報告基團和熒光淬滅基團分別位于核酸外切酶識別位點兩側(cè)，所述阻抑聚合酶延伸或擴增的基團位于檢測探針的3’末端。

更進一步地，上述核酸外切酶識別位點是四氫呋喃。

所述熒光報告基團是FAM、Cy3、Cy5、HEX、TET、JOE、VIC中的任意一種；

所述熒光淬滅基團是BHQ、TAMRA、Eclipse中的任意一種；