[發明專利]一種干細胞來源的類原腸胚模型及其構建方法和應用

在審

• 申請號: 202211135940.2
• 申請日: 2022-09-19
• 公開（公告）號: CN116590219A
• 公開（公告）日: 2023-08-15
• 發明（設計）人: 沙家豪;袁艷;員格格
• 申請（專利權）人: 蘇州南醫大創新中心
• 主分類號: C12N5/073
• 分類號: C12N5/073;C12Q1/02
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司 32218
• 代理人: 競存;徐冬濤

1.一種類原腸胚模型的構建方法，其特征在于，包括以下步驟，

(1)在多能干細胞長至80-90％匯合度時將細胞消化為單細胞，使用PBS將細胞進行重懸，得到細胞懸液1；

取細胞懸液1加入含有Y-27632的G1ER培養基進一步重懸細胞，得到細胞懸液2；

將細胞懸液2接種到提前使用抗黏附溶液進行包被的類胚體培養板中，離心；

培養第二天采用G1ER培養基換半液，每天換半液至培養直至形成原始內、外胚盤；

優選的，所述細胞懸液1與含有Y-27632的G1ER培養基的比例為：每包含7.5-9.0×10⁴個細胞的細胞懸液1中加入2ml含有Y-27632的G1ER培養基；

優選的，所述細胞懸液2接種的每微孔細胞量為50-75個細胞；

(2)將(1)培養板各孔中的G1ER培養基棄去1/2～3/4體積后加入G2EE培養基培養，進行羊膜腔預誘導；

(3)將(2)培養板各孔中的G2EE培養基棄去1/2～3/4體積后加入aG2EE培養基培養，誘導形成羊膜細胞；

(4)將(3)培養板各孔中的aG2EE培養基棄去1/2～3/4體積后加入bG2EE培養基培養；直至誘導得到羊膜細胞、原條細胞、原始生殖細胞，獲得所述植入后類原腸胚模型。

2.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于，所述多能干細胞為誘導多能干細胞或胚胎干細胞；優選的，為人源誘導多能干細胞或胚胎干細胞。

3.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于，步驟(1)所述G1ER培養基的成分包含：體積百分比為50％的G-1^TM?Plus卵裂球培養基、25％的Essential?8培養基和25％的RACL培養基；

所述RACL培養基包含體積百分比為95％-98.5％的基礎培養基RPMI?1640(含有GlutaMAX)、體積百分比為1％的B27添加劑、體積百分比為0.5％的青霉素-鏈霉素雙抗、0.1mM非必須氨基酸、0.1mMβ-巰基乙醇，100ng/ml重組人激活素A蛋白、20ng/ml重組人白細胞因子蛋白、3μM?CHIR?99021；

含有Y-27632的G1ER培養基的成分包含：

體積百分比為50％的G-1^TMPlus卵裂球培養基、25％的Essential?8培養基和25％的RACL培養基；所述RACL培養基包含95％-98.5％的基礎培養基RPMI?1640(含有GlutaMAX)、體積百分比為1％的B27添加劑、體積百分比為0.5％的青霉素-鏈霉素雙抗、0.1mM非必須氨基酸、0.1mMβ-巰基乙醇，100ng/ml重組人激活素A蛋白、20ng/ml重組人白細胞因子蛋白、3μM?CHIR?99021、10μM?Y-27632。

4.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于，步驟(2)所述G2EE培養基的成分包含：體積百分比為50％的G-2^TM?Plus胚胎培養基、25％的Essential?8培養基和25％的EBB培養基；所述EBB培養基包含100％的Essential?6培養基、20ng/ml重組人骨形態發生蛋白4、10ng/ml重組人成纖維細胞生長因子2。

5.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于，步驟(3)所述aG2EE培養基的成分包含：體積百分比為50％的G-2^TM?Plus胚胎培養基、25％的Essential?8培養基和25％的aEBB培養基；所述aEBB培養基包含100％的Essential?6培養基、100ng/ml重組人骨形態發生4蛋白、10ng/ml重組人成纖維細胞生長因子2。

6.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于，步驟(4)所述bG2EE培養基的成分包含：

體積百分比為50％的G-2^TM?Plus胚胎培養基、25％的Essential?8培養基和25％的bEBB培養基；所述bEBB培養基包含100％的Essential?6培養基、75ng/ml重組人骨形態發生4蛋白、10ng/ml重組人成纖維細胞生長因子2。