[發(fā)明專利]一種鐵皮石斛莖腐病組培苗抗性鑒定方法

在審

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• 申請日: 2022-09-09
• 公開（公告）號: CN115380824A
• 公開（公告）日: 2022-11-25
• 發(fā)明（設計）人: 羅凱;白燕冰;殷山山;李澤生;周候光;李桂琳;白學慧;姜艷;胡永亮;賈敏
• 申請（專利權）人: 云南省德宏熱帶農業(yè)科學研究所
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00;A01G7/00;C12Q1/04;C12Q1/24;C12R1/77
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本發(fā)明涉及抗莖腐病鐵皮石斛種質鑒定技術，本發(fā)明鐵皮石斛莖腐病組培苗抗性鑒定的方法，包括如下步驟：（1）病害部位的子實體分離純化培養(yǎng)，病原菌分子鑒定；（2）配制組培苗培養(yǎng)基，轉入組培苗培養(yǎng)；（3）配制接種菌液液體培養(yǎng)基，制備1×10⁶個/mL的孢子懸浮液；（4）無菌棉簽頭蘸取孢子懸浮液，緊貼鐵皮石斛組培苗放到培養(yǎng)基上接種；（5）接種后進行病情調查，依據病情指數評價鐵皮石斛種質資源抗病性。本發(fā)明彌補了鐵皮石斛種質抗病性鑒定技術的空白，提供一種操作簡單、準確、快速的鐵皮石斛莖腐病組培苗抗性鑒定方法。

技術領域

本發(fā)明涉及一種鐵皮石斛莖腐病組培苗抗性鑒定方法，屬于植物病理學研究技術領域。

背景技術

鐵皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）為蘭科石斛屬植物，是我國重要的藥用植物，具有“養(yǎng)陰生津、潤喉護嗓、溫胃明目、補腎益力、延年益壽”等功效，道家醫(yī)學經典《道藏》把鐵皮石斛稱為九大仙草之首，被列入《中華人民共和國藥典》（2020版），也具有重要的觀賞價值。隨著組培技術的快速發(fā)展和栽培水平不斷提高，人工種植的鐵皮石斛種植面積不斷增加，鐵皮石斛莖腐病成為了主要的病害，其主要在夏季、秋季兩季高溫高濕的環(huán)境中發(fā)生，具有較明顯的發(fā)病中心，葉片呈水漬狀，假鱗莖軟化枯萎，假鱗莖基部可見淡黃色霉狀物，發(fā)病嚴重時，葉片全部失綠或脫落，整株失綠枯萎。鐵皮石斛莖腐病主要采用化學藥劑防治，不同鐵皮石斛品種對于莖腐病的抗病和感病程度不同，利用抗病品種防治鐵皮石斛莖腐病也是一種重要的防治手段，抗病品種的選育和利用離不開鐵皮石斛莖腐病病害抗性鑒定。目前常用的植物抗病鑒定方法是種子侵染接種、幼苗期噴霧接種、灌根接種、離體葉片接種等，尚未見到鐵皮石斛莖腐病抗性鑒定的方法，嚴重制約了鐵皮石斛莖腐病抗病性品種的選育，因此，探索一種操作簡單、準確、快速的鐵皮石斛莖腐病組培苗抗性鑒定方法，采用科學有效的方法評價和鑒定不同鐵皮石斛品種的抗病性，為篩選抗病鐵皮石斛種質資源和新品種提供科學方法。

發(fā)明內容

本發(fā)明根據上述領域存在的空白和技術需求，提供一種操作簡單、準確、快速的鐵皮石斛莖腐病組培苗抗性鑒定方法。

本發(fā)明是以如下技術方案實現的，一種鐵皮石斛莖腐病組培苗抗性鑒定方法，按如下步驟進行：

（1）病原菌分離與鑒定：觀察并用無菌解剖針挑取鐵皮石斛莖腐病病害部位的子實體，用無菌的濾紙吸干其表面水分，將子實體移至PDA培養(yǎng)基上，25℃避光培養(yǎng)，再將培養(yǎng)物進行劃線純化培養(yǎng)，即可獲得純培養(yǎng)鐵皮石斛莖腐病病原菌菌株，提取菌株的DNA進行PCR擴增，將得到的PCR擴增產物進行凝膠電泳分析，PCR產物進行測序，測得序列向NCBI數據庫提交并進行DNA序列對比，鐵皮石斛莖腐病病原菌為尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)，鐵皮石斛莖腐病病害部位的子實體為尖孢鐮刀菌無性階段的分生孢子座。

（2）組培苗及培養(yǎng)基的準備：優(yōu)選組培苗培養(yǎng)基，挑選不同鐵皮石斛種質資源生根壯苗培養(yǎng)后生長一致的組培苗，轉入盛有組培苗培養(yǎng)基的650ml組培瓶中，每瓶接3株，9h光照15h黑暗25℃培養(yǎng)15d。

（3）接種菌液的培養(yǎng)及配制：優(yōu)選接種菌液液體培養(yǎng)基，將鐵皮石斛莖腐病病原菌菌株轉接至PDA培養(yǎng)基上25℃恒溫避光培養(yǎng)7d，用打孔器在菌落邊緣打取菌餅，挑取3個菌餅放置于裝有接種菌液液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，于12h光照12h黑暗，25℃恒溫，130r/min振蕩培養(yǎng)3d，用4層紗布過濾得到分生孢子濾液，加入無菌水稀釋并采用血球計數板調整孢子濃度，得到濃度為1×10⁶個/mL的孢子懸浮液。

（4）接種：剪下無菌棉簽的棉簽頭，蘸取孢子懸浮液，然后將棉簽頭緊貼鐵皮石斛組培苗放到培養(yǎng)基上，每份鐵皮石斛種質資源接種5瓶，3次重復，棉簽頭蘸取無菌水的鐵皮石斛組培苗為對照，9h光照15h黑暗25℃培養(yǎng)。