[發(fā)明專利]腈水解酶突變體及其應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202211090097.0
• 申請日: 2022-09-07
• 公開（公告）號: CN116426511A
• 公開（公告）日: 2023-07-14
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 吳堅平;楊麗媛;張紅玉;徐剛;楊立榮
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)杭州國際科創(chuàng)中心
• 主分類號: C12N9/78
• 分類號: C12N9/78;C12N15/55;C12N15/70;C12N1/21;C12P7/40;C12R1/19
• 代理公司: 杭州知閑專利代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 33315
• 代理人: 萬靜

本發(fā)明公開了一種腈水解酶突變體及其應(yīng)用，腈水解酶突變體由NCBI登錄號為Q03217.2的野生型腈水解酶突變所得，如：T171P/T173E/H181F/S188G；T171P/T173E/H181F/N146D；T171P/T173E/H181F/T225A等；N146D/T171P/T173E/H181F/T225A。本發(fā)明以野生型腈水解酶為基礎(chǔ)，通過突變獲得了能夠高效催化較大位阻芳香族腈類底物的腈水解酶突變體，不僅酶活高，而且催化效率高。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及酶工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及腈水解酶突變體、編碼基因及其在制備對甲氧基苯甲酸或間氯苯甲酸的應(yīng)用。

背景技術(shù)

腈(Nitrile)是一類非常重要的化合物，種類繁多，常見的如乙腈、丙烯腈、苯甲腈、苯乙腈、3-腈基吡啶等。由腈化合物出發(fā)可以獲得酰胺、酸、酯等價值更高、應(yīng)用范圍更廣的一類化合物，它們被廣泛的應(yīng)用于化工原料、醫(yī)藥中間體、維生素的前體。由于腈的化學(xué)水解需要強酸(或強堿)等苛刻的反應(yīng)條件，并且副產(chǎn)物多、環(huán)境污染嚴(yán)重，極大地限制了其產(chǎn)業(yè)應(yīng)用。

腈水解酶(Nitrilase)在有機合成和生物降解方面有著重要的作用，腈水解酶可以將腈轉(zhuǎn)化成酸，在催化過程中，反應(yīng)條件較溫并且副產(chǎn)物較少，后續(xù)分離純化工藝較簡便。因此，已經(jīng)在醫(yī)藥、環(huán)保、化工、食品添加劑、農(nóng)業(yè)等化學(xué)品的生產(chǎn)方面得到了廣泛的應(yīng)用。腈水解酶根據(jù)底物偏好性可以分為脂肪族腈水解酶、芳香族腈水解以及芳基乙腈腈水解酶，其中有些腈水解酶可以同時具有催化脂肪族和芳香族腈類底物的活力，芳基乙腈腈水解酶一般具有對映選擇性。在芳香族腈類底物中，由于底物自身的結(jié)構(gòu)特征，一般是帶有苯環(huán)、聯(lián)苯等結(jié)構(gòu)使得該類底物相較于脂肪族腈類底物而言空間位阻較大從而使得酶催化反應(yīng)較為困難，并且不同側(cè)鏈基團的電子效應(yīng)也會影響酶催化反應(yīng)，從而導(dǎo)致目前自然界中存在的野生型腈水解酶對這一類底物的催化活力普遍較低，往往達不到工業(yè)生產(chǎn)的要求。通過基因探礦技術(shù)能夠從自然界這一巨大的“天然酶庫”中篩選出對目標(biāo)底物具有酶活的較優(yōu)異的野生型菌株，基于此，通過理性設(shè)計、定向進化等方法對野生型進行改造后能夠得到酶活、穩(wěn)定性、選擇性等多方面提高的且符合要求的工業(yè)生產(chǎn)要求的突變體菌株。

目前，在成百上千種芳香族腈類底物中，利用腈水解酶對3-氰基吡啶、扁桃腈、鄰氯扁桃腈進行生物催化研究報道較多且較為成熟，而對于較大位阻芳香族腈類底物鮮有研究。

對甲氧基苯甲酸，又名為大茴香酸，分子式為C₈H₈O₃。對甲氧基苯甲酸是許多藥物及香料的中間體。對甲氧基苯甲酸合成工藝目前僅涉及化學(xué)合成法，主要有以甲基苯酚為起始原料進行甲基化反應(yīng)進行化學(xué)合成；以對羥基苯甲酸、對甲氧基芐醇、對甲氧基溴苯、對甲氧基苯乙酮等為原料合成對甲氧基苯甲酸，但此類方法原料成本高且需重金屬催化對環(huán)境污染嚴(yán)重。相較化學(xué)合成法而言，生物酶法催化反應(yīng)條件溫和、對環(huán)境友好、能有效降低成本。間氯苯甲酸，分子式為C₇H₅ClO₂，主要作為醫(yī)藥中間體用于合成抗抑郁藥物鹽酸安非他酮的關(guān)鍵中間體α-溴代間氯苯丙酮；也可作為精細(xì)化工原料用于合成分子中含間氯苯環(huán)結(jié)構(gòu)的精細(xì)化工產(chǎn)品同時還可作為其它醫(yī)藥、農(nóng)藥中間體等。其合成方法主要以化學(xué)合成法為主：由2-氨基-5-氯苯甲酸脫氨基而得產(chǎn)品收率只能達到89％；由間氯三氯甲苯水解環(huán)境污染大；由苯甲酸氯化而得但副產(chǎn)物較多，難以分離提純；間氯甲苯高錳酸鉀氧化法產(chǎn)品成本高環(huán)境污染大等化學(xué)合成方法。目前尚未有直接應(yīng)用活性高的腈水解酶生物催化合成對甲氧基苯甲酸和間氯苯甲酸的研究報道。

鑒于此，特提出本發(fā)明。在研究對甲氧基苯腈及間氯苯腈的基礎(chǔ)上，挖掘出一株對較大位阻芳香族腈類底物普遍具有催化活力的催化效率高、反應(yīng)條件溫和、符合綠色化學(xué)理念的腈水解酶突變體菌株，適應(yīng)工業(yè)化生產(chǎn)的需求。

發(fā)明內(nèi)容